發佈時間： 2003-8-12 作者：繆曉輝 孔憲濤
近年來HBV基因定量分析的價值受到越來越多研究者的重視[1]。過去由於過分強調了HBV感染後過強的細胞免疫應答介導肝細胞損傷，忽視了對病毒複製水平與致病性之間因果關係的研究。目前普遍認爲，儘管HBV不直接破壞寄生細胞，但病毒的活躍複製是啓動或激發肝臟組織炎症反應的因素。這表明確定感染者體內HBV複製狀態，即從HBV基因定量的角度作病情分析是十分有意義的。事實上，真正引起人們關注HBV基因定量分析價值的重要原因是最近發現了干擾素治療與HBV基因水平兩者之間有非常密切的關係。HBV基因定量分析還在轉基因動物、基因治療、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV藥物體外試驗和動物試驗及耐藥研究、流行病學研究、HBV血液製品污染監測等方面具有重要的應用價值。
一、HBV基因定量分析在干擾素治療中的應用
尚無藥物可以清除所有HBV感染者體內HBV顆粒。干擾素是目前唯一有一定療效的一類生物製劑[2],它在病毒等誘導下由幾種相關細胞產生，併發揮抗病毒作用。但是無論使用何種干擾素，也無論治療劑量或療程如何，干擾素治療後HBV轉陰率迄今仍保持在40%左右，無法進一步提高，究竟有哪些制約因素起作用尚無定論。
近年來發現干擾素的治療效果，即干擾素治療後的反應性(response)很大程度上取決於HBV在體內的複製水平[2,3]。以下幾點事實值得注意:⑴治療前HBV低水平復制者的反應性明顯優於高水平復制者。HBV轉陰的幾乎都是那些治療前血清HBV DNA含量較低者，而治療前HBV DNA含量特別高者大多沒有療效；⑵治療中病毒複製水平迅速降低者，有望治癒。相反，治療期間HBV基因水平下降較慢，或下降幅度較小，或變化不明顯者，大多是無效者；⑶治療結束後，採用PCR定量法檢測，HBV DNA完全轉陰者可能不再復發，而終止治療後HBV DNA仍保持較低水平者，反跳的可能性較大。可見，使用干擾素治療HBV感染時，在各種近期和遠期療效指標中，除了病人的臨牀表現是否好轉，生化指標(ALT)是否改善，肝組織炎症反應是否減輕等以外，血清HBV DNA定量分析是一個十分重要的觀察項目。從現有研究資料看，除病理檢查外，HBV DNA定量檢測，也許是干擾素治療效果判斷依據中最直接、最可靠和最有價值的指標。多數研究者認爲，透過HBV DNA定量分析來指導干擾素治療，有重大意義。首先，在治療對象的選擇方面，即確定干擾素治療適應症時，應對各侯選病例在某個時間段內定期反覆檢? 釮BV DNA水平，那些長期保持HBV高複製水平者不宜接受干擾並素治療，或應當聯合治療；其次，干擾素治療期間，可根據HBV基因水平的動態變化適時調整治療劑量，決定是否縮短或延長療程，及是否終止治療。這不僅對制訂合理的治療方案，也對減輕病人負擔，避免不恰當用藥有指導意義[4]。筆者認爲，目前國際上普遍採用的所謂“六個月療程”及某些中高劑量治療方案均缺乏充分和足夠的立論依據，有必要結合基因定量分析結果，重新評價和制訂干擾素治療計劃；最後，干擾素治療結束後，對有反應者定期作定量分析，有助於發現復發者，並根據血清HBV DNA含量波動情況決定是否實施再治療。有人報告，首次干擾素治療有效者，再治療的效果亦佳。如果第一次治療無反應或反應較差者，第二次干擾素治療仍不能取得理想療效[5]。
二、HBV基因定量分析的其他臨牀價值
HBV感染後，在臨牀表現方面的差異非常明顯,可以表現爲無症狀攜帶者、急性肝炎、慢性肝炎、暴發型肝炎、肝硬化及肝癌等多種疾病狀態。病毒在肝細胞內的複製水平與各種臨牀疾病狀態之間可能存在着某些必然聯繫。由於HBV基因定量技術的發展和成熟，目前已有可能從某些現象上闡明HBV複製與致病性之間的“量效”關係。
㈠“無症狀攜帶者”可能爲活動性乙肝患者[6]。有部分HBV感染者，由於免疫耐受或其它原因，體內HBV呈複製不活躍的“潛伏”狀態，但並不意味着不存在進行性肝損害。Mels等研究發現無症狀攜帶者在其自然發展史上，HBV複製處於波動狀態，時有加劇，病毒複製積累到一定程度後ALT水平增加。一般規律是:血清HBV DNA水平上升® ALT活性增加® IgM抗HBc滴度提高。因此無症狀攜帶者應採取積極治療措施，否則這類人羣不僅作爲重要的病毒庫傳播HBV，而且由於隱匿性肝細胞損傷的不斷積累，不經過慢性肝炎階段，直接向肝硬化和肝癌發展。
㈡HBV DNA水平與HBV感染者病情和預後的關係密切。上述無症狀攜帶者是一個特殊羣體。而對那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，HBV DNA水平對預後判斷有幫助。研究發現HBV DNA一直保持較高水平的急性肝炎患者易慢性化，而HBV複製水平較高的慢性肝炎患者不僅對干擾素治療的反應性差，而且肝組織炎症反應更明顯，病情更重，更易發生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA水平來判斷肝組織炎症損傷程度這類問題上尚有爭議。動物實驗表明，鴨肝被DHBV廣泛感染的同時，並不伴隨明顯病毒血症,肝細胞清除病毒的同時也無病毒血症加重的證據[7]。然而最近有人對HCV感染者進行基因定量分析研究，發現HCV RNA水平與ALT水平以及肝臟knodell分級之間有密切關係[8]。
㈢肝移植者HBV DNA定量的.意義
Mazzaferro等報告肝移植前患者血清HBV DNA水平的高低決定移植後肝臟是否再感染HBV[9]。作者觀察到，14例移植前血清HBV DNA含量低於103拷貝/ml，移植後不間斷地採用HBsAb免疫預防，隨訪36個月，無一例再發肝炎，但另外兩例移植前病毒拷貝數大於105/ml則發生了嚴重HBV再感染。建議移植前使用抗HBV藥物，最大限度降低血清HBV DNA濃度，有助於防止HBV侵犯移植後肝臟，提高肝臟移植的效果。
㈣前核基因突變HBV定量意義
HBV前核基因突變可導致HBeAg表達缺失。感染不表達HBeAg的HBV突變株，或野生型HBV在體內突變併成爲優勢株均產生較嚴重的後果，如易發生暴發性肝炎，預後差，干擾素治療無效等[9,10]。目前已能採用核酸序列測定技術、PCR技術、限制性片段長度多態性(RFLP)分析技術等來定性檢測HBV前核基因突變。最近Baxall建立了一種PCR及產物的顯色反應點突變分析技術(Colourimetric point mutation assay)，用來定量分析突變前核基因，有助於進一步探討HBV突變與致病性之間的關係[11]。
基因定量分析是一項臨牀應用型技術，但對基礎研究也有一定的應用價值[12]，尤其是在當前基因治療、轉基因動物、核酸疫苗等熱點研究領域，基因定量分析可能是一種很好的輔助手段，對發現一些有意義的現象也許有一定幫助。比如HBV在轉基因小鼠組織臟器分佈規律可用定量標準來衡量，以及用定量手段觀察各種藥物、細胞因子和其它物質對轉基因小鼠HBV基因複製的調節作用。又如對核酸疫苗注入肌組織後的各種動力學變化的研究遠未深入，如能採用定量手段，分析抗原表達基因在體內的存在狀態無疑是有益的。至於各種抗HBV藥物，無論是在體外細胞模型(包括轉基因細胞模型)還是在動物模型的研究，或在人體研究，採用基因定量分析，應當是考覈藥物療效的最佳手段[13]。
HBV因定量分析存在的問題及未來展望
HBV基因定量技術的發展歷史不長，但由於有定性技術爲基礎，以及與其它學科方法的融匯，發展速度很快，目前趨於成熟。但應用定量技術去研究HBV感染的臨牀問題還不充分，同時定量技術本身也有許多問題值得探討。
一、國際標準化。這是一個最爲突出而又必須儘快解決的問題。歐洲有一個“病毒性肝炎研究組”（European Study Group in Viral Hepatitis)，經常向歐洲的某些研究機構提供HBV血漿標準品作定量分析參考[14]。有必要在國際上設立統一的HBV基因標準品，包括各種HBV亞型的標準參照。筆者認爲，克隆的HBV DNA質粒不適宜作標準品。克隆HBV DNA與載體構成了閉環超螺旋結構，而且，一級結構單一，這與體內存在的HBV基因結構差異很大。後者呈部分雙鏈，在血清中尚有裂解片段及複製中間體等形式。因此，無論是在分子雜交，還是在PCR過程中，質粒HBV DNA結構與人體內感染的HBV DNA結構在雜交效率或擴增效率上必然有細微差別，結果將影響定量分析的準確性。如從高水平HBV陽性病人血清大量抽提，或從轉基動物血液中純化得到HBV DNA，可能是一個製備標準品的途徑。總之，國際化的標準參照，是保證HBV DNA定量技術精確性和可靠性的前提。
二、分子雜交定量技術和PCR定量技術應當共存下去嗎? 以下兩點值得考慮:首先，有必要弄清體內HBV複製水平極低者(如低於1fg/ml)佔HBV感染人數的比例有多大？這類低水平復制者預後如何?如果這類人羣屬於急性感染恢復期，或有自然清除病毒傾向者，那麼似無必要作常規PCR定量分析，定期進行PCR定性檢測即可。其次，有必要建立一種敏感度介於分子雜交和PCR定量技術之間的檢測系統。最近有人利用電化學技術觀察到DNA雙鏈互補雜交，甚至單個鹼基對結合時發生了微電反應，這給我們以很大啓示，今後如有可能在這方面開啟突破口，那麼基因定量分析兩大技術共存的局面會發生轉變。但是，在目前這兩大技術仍有很強的互補性。
三、HBV突變株定量分析意義的研究。HBV基因突變[15]，尤其是前核基因突變，直接影響HBV感染病情轉歸及抗毒治療效果，同時也反映了來自體內或外界選擇壓力的作用。因此，突變株在體內產生的確切原因，突變株與野生株混合存在的發展趨向，突變株是否爲耐藥株，突變株與野生株相對含量的變化與致病性的關係，突變株與免疫耐受的關係等均是有必要進一步澄清的問題。
四、基因定量技術在HBV感染流行病學方面的應用[16]。HBV經血液傳播致病已十分明確，但是體液傳播的問題還必須有充足的證據來補充。體液及其它分泌液或排泄物傳播HBV是日常生活密切接後感染HBV的直接原因，但其中必然存在“含量與傳染性”的關係，那麼這個致病的量值完全可以透過HBV感染流行病學研究得到確證。另外，被污染血製品中HBV基因含量與使用血製品後感染HBV的危險性之間的關係也值得研究。
五、加強HBV低水平復制者預後研究。目前看來，所謂健康攜帶者或無症狀帶病毒者、干擾素治療部分反應者(partial responders),以及其他種種HBV在體內呈低複製狀態者，在病情、機體免疫狀態、預後等方面可能都有一些特殊性，這類病人是否有自然清除病毒的傾向，是否應當實施抗病毒治療，是否成爲重要的傳染源等問題都應該作出符合實際的回答。
六、HBV複製水平與抗病毒藥物療效之間的關係研究有待深入。筆者認爲，HBV DNA水平與干擾素治療效果之間的所謂聯繫在理論上缺乏根據，可能是一種表面現象，有必要探討其本質。病毒複製水平高低取決於病毒自身的生物活性和機體的免疫功能，應當從病毒和機體兩方面尋找突破口，提高干擾素抗HBV的效果。
最後，在中國，有世界上爲數最衆的HBV感染及相關慢性肝病患者，但我們在HBV感染診治研究方面仍處於落後狀態。就HBV定量技術而言，目前尚未建立分子雜交定量分析技術，現已報告的PCR定量分析法也屬於低水平重複，今後有必要重視這方面的投資和開發。在臨牀研究領域應當有自己的立足點，不應簡單重複國外研究結果。就HBV DNA定量分析意義的研究而言，簡單重複的現象已不鮮見，必須引以爲戒。
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