細胞工程是生物工程的一個重要方面。總的來說，它是應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法，按照人們的設計藍圖，進行在細胞水平上的遺傳操作及進行大規模的細胞和組織培養。下面是小編爲大家整理的細胞工程論文，歡迎閱讀。
【摘要】目的製作去細胞肌肉組織工程支架，並檢測其與人羊膜上皮細胞的生物相容性。方法 採用TNT和十二烷基磺酸鈉結合的化學萃取方法制作去細胞肌肉組織工程支架，冰凍切片觀察其結構。將人羊膜上皮細胞種入支架培養7 d後，用免疫組化檢測羊膜上皮細胞的增殖活性、NT3及BDNF的表達,掃描電子顯微鏡觀察其超微結構。結果 支架中細胞去除完全，其主要結構爲平行排列的管狀結構。細胞外基質的主要成分彈性纖維和膠原纖維保持完好。羊膜上皮細胞在支架裏有增殖活性，並呈現NT3、BDNF免疫反應陽性。掃描電鏡顯示，羊膜上皮細胞在支架中分佈均勻，生長良好。結論 成功的製作了去細胞肌肉組織工程支架，其與人羊膜上皮細胞有良好的相容性。
【關鍵詞】去細胞肌肉;人羊膜上皮細胞;生物相容性
近年來組織工程研究的重要進展之一就是採用自體或異體移植物製作天然生物降解材料的組織工程支架。其中去細胞移植物與機體有良好的生物相容性。去細胞肌肉支架可作爲生物工程支架支援神經細胞軸突再生。Mligiliche等〔1〕把去細胞肌肉移植入大鼠坐骨神經缺損處,4 w後發現有大量神經軸突長入去細胞肌肉支架中。由於單獨應用去細胞肌肉支架治療神經系統疾病的效果有限，去細胞肌肉支架要發揮更大的作用往往需要向支架中植入種子細胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮細胞可分泌多種神經因子〔4，5〕，促進神經元軸突的生長，是一種良好的治療神經系統疾病的種子細胞。本研究利用化學去細胞的方法制成去細胞肌肉支架，並把羊膜上皮細胞種入去細胞肌肉支架內，探究兩者的相容性，爲開展組織工程治療神經系統方面的疾病提供新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 Wistar 大鼠由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。
1.1.2 試劑 IMDM培養基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 單克隆抗體購自Neomarker公司;神經營養素(NT)3,腦源性神經營養因子(BDNF)兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德公司，SABC免疫組化試劑盒購自福州邁新生物公司。人羊膜上皮細胞株爲本實驗室儲存。
1.2 方法
1.2.1 去細胞肌肉支架的製備 參考 Brown等〔6〕去細胞膀胱的製作方法制備去細胞肌肉支架，簡述如下：取Wistar大鼠腹鋸肌，放入蒸餾水中，在搖牀中以37℃、50 r/min搖48 h後,轉入3%的TritonX100溶液,搖牀中37℃、50 r/min搖48 h。然後放入蒸餾水中，搖牀37℃、50 r/min搖48 h。換成1% SDS溶液，搖牀37℃，50 r/min搖48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃儲存備用。
1.2.2 支架形態結構的觀察及成分鑑定 肉眼觀察去細胞肌肉的形態。去細胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖過夜以梯度脫水，OCT包埋，冷丙酮速凍，之後放入-70℃冰箱儲存。恆冷箱切片機切片，HE 染色，觀察其內部結構。此外對切片進行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)檢測支架的細胞外基質成分。
1.2.3 人羊膜上皮細胞的培養 人羊膜上皮細胞在DMEM培養液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青黴素，100 mg/ml鏈黴素，200 μg/ml的谷氨醯胺)，37℃、5 % CO2及飽和溼度條件下的細胞培養箱中培養，隔天換液，待單層培養細胞生長至80%匯合後，傳代培養。
1.2.4 人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架相容性的鑑定
取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合，棄去培養液，0.25%胰蛋白酶消化，當胞體回縮，細胞間隙變寬時，用血清終止消化，反覆輕吹瓶壁細胞，製成單細胞懸液於離心管中，1 000 r/min，離心3 min。用DMEM重懸細胞。用1 ml注射器吸入細胞懸液，以2×106/ml 密度注入去細胞肌肉支架中分裝至24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和溼度條件下的細胞培養箱中培養，隔天換液，培養1 w。摻入Brdu(終濃度爲10 mg/L)，繼續培養1 d後，恆冷箱切片機切片(方法同前)。切片經PBS 洗後，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min，血清封閉20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀釋)單克隆抗體，BDNF和NT3多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，PBS 洗後，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗後，SABC37℃孵育30 min，DAB顯色。光鏡下觀察。
掃描電子顯微鏡鑑定羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架上的生長情況 取生長良好的人羊膜上皮細胞，80%細胞接近融合時，用上述方法消化下來後，把羊膜上皮細胞種植到去細胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和溼度條件下的細胞培養箱中培養7 d後，用2%戊二醛固定後，梯度乙醇脫水，CO2臨界點乾燥，鍍膜，採用掃描電子顯微鏡觀察並拍照。
2 結 果
2.1 支架的組織結構與成分 去細胞肌肉外觀呈乳白色,半透明,質地柔軟。從大體上看，肌肉去細胞前後整體大小與形狀無顯著變化。支架縱切面的HE染色觀察可見骨骼肌細胞成分消失,而纖維網架結構保持完整，支架內主要爲平行管道。VG+ET染色證明支架成分主要爲膠原纖維和彈力纖維等細胞外基質成分，膠原纖維爲紅色波浪狀結構，彈性纖維爲藍色絲狀結構，見圖1。
2.2 羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架的相容性 見圖2，HE染色顯示人羊膜上皮細胞在支架中生長良好，分佈均勻(圖
圖1 去細胞肌肉支架大體與組織切片染色
圖2 去細胞肌肉支架的病理圖片2A)。免疫組化染色顯示，BrdU陽性細胞數目多，提示支架中的人羊膜上皮細胞有增殖能力(圖2B)。抗NT3和BDNF染色顯示，支架中的人羊膜上皮細胞含有NT3、BDNF陽性顆粒，呈棕褐色分佈在細胞質中(圖2C，2D)。JSM5600LV掃描電子顯微鏡顯示，在支架內部分佈有大量細胞，細胞在支架中分佈比較均勻，生長狀態良好(圖2E)。
3 討 論
理想的支架材料應與細胞外基質類似，與活體細胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去細胞肌肉作爲治療神經損傷的生物工程支架材料有如下優勢：(1)去細胞肌肉的細胞外基質成分對組織細胞的'遷移、黏附、生長代謝都有重要作用，研究表明再生的軸突可以很好的黏附在去細胞肌肉支架上〔9〕。(2)去細胞肌肉的排列結構與神經膜管類似,僅在直徑上略大於神經膜管〔10〕，它們提供了軸突可生長穿過的足夠空間〔9〕，該結構對於誘導神經軸突再生是十分重要的。 Fansa等比較了接種施萬細胞的不同去細胞生物材料(肌肉，靜脈，神經外膜)橋接缺損的外周神經的結果，發現缺乏神經膜管樣結構的去細胞肌肉支架(靜脈和神經外膜支架)中的再生軸突是無序和排列混亂的，而有神經膜管樣結構的去細胞肌肉支架中的再生軸突是有序排列的〔11〕。這種軸突再生的有序性對神經損傷的軸突再生同樣也是十分重要的。(3)去細胞肌肉引起的免疫排斥反應較小〔9，12〕。這些優勢都說明去細胞肌肉可作爲治療神經損傷的理想的材料。本研究採用的製作去細胞肌肉的方法主要用來減少異種移植材料的免疫排斥反應。該方法能有效的去除脂膜和膜相關抗原以及可溶性蛋白，並能有效的保留細胞外基質成分的原始空間結構。肌細胞正常呈平行分佈，其細胞外基質成分也是平行分佈的，從支架縱切面的結果看支架的纖維成分也是平行排布的，VG+ET染色結果顯示細胞外基質的主要成分膠原纖維和彈性纖維保持完好。這些結果進一步證實此方法可成功製備去細胞肌肉支架。
由於單獨應用去細胞肌肉支架治療神經系統疾病的效果有限〔13〕，去細胞肌肉的生物相容性也有待驗證。本研究用人羊膜上皮細胞作爲種子細胞種入去細胞肌肉支架以探討其相容性。研究表明，羊膜上皮細胞中含有多種生物活性因子，包括黏蛋白、轉移生長因子、前列腺素E、表皮生長因子樣物質,IL1，IL8 等因子，另外，還可分泌BDNF和NT3等重要的神經營養因子〔4〕。其中層黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子對神經損傷的治療具有十分重要的作用。羊膜上皮細胞可作爲一種較理想的種子細胞，與去細胞肌肉支架結合可能成爲治療神經系統疾病的一個理想的組織工程材料。本實驗觀察到人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中分佈均勻，抗BrdU、BDNF及NT3免疫組化顯示去細胞肌肉支架中羊膜上皮細胞有良好的增殖能力，並能表達BDNF和NT3，說明羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中保持了良好的生物學活性。以上結果一方面證明了本研究製作的去細胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面爲應用羊膜上皮細胞和去細胞肌肉支架結合治療神經系統疾病提供了理論和實驗基礎。
總之 ，本研究成功製備了去細胞肌肉支架，並證實人羊膜上皮細胞在去細胞肌肉支架中能分泌重要的神經營養因子，人羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體爲神經缺損再生提供了基底膜、神經營養因子等種種有利因素，構成了良好的神經再生微環境，有利於使神經缺損得到較好地修復，爲進一步研究羊膜上皮細胞與去細胞肌肉支架橋接體治療神經損傷奠定了一定的實驗基礎。
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