間充質幹細胞具有較強的增殖能力和多向分化能力，以下是小編蒐集的一篇關於間充質幹細胞分離研究的論文範文，歡迎閱讀參考。
前言
間充質幹細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是來源於中胚層的未分化的發育早期細胞，具有較強的增殖能力和多向分化能力。在特定的內環境和一定的細胞因子的誘導作用下，其可定向分化爲多種組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞、神經細胞、成纖維細胞等，正是由於其所具有的特性，使其成爲了組織工程學中最常用的種子細胞。
由於骨髓間充質幹細胞(bonemarrow mesenchymalstemcells, BMSCs)具有取材方便、體外培養簡單、繁殖能力強、供體創傷小、不涉及倫理問題、良好的組織相容性、及其低抗原性所表現出的低免疫反應性等優點，使其成爲了組織工程中經常使用的間充質幹細胞。國內外均有使用一定的細胞因子誘導BMSCs增殖和分化爲類軟骨細胞及類髓核細胞的相關報道。本實驗抽取新西蘭兔的骨髓細胞，利用全骨髓貼壁法分離間充質幹細胞，經過傳代培養後再透過中胚層定向誘導分化的方法對所獲取的細胞進行鑑定，確定其定向分化能力，再以轉化生長因子 3(Transforming Growth Factor- 3,TGF- )和骨形態發生蛋白 7(Bone Morphogenetic Protein -7,BMP-7)生長因子誘導其向類髓核細胞分化，爲組織工程髓核的構建提供良好的種子細胞選擇。
1、材料和方法
1.1 材料與試劑
DMEM-LG 培養基(Gibcol)、胎牛血清(Gibcol)、DMEM-HG 培養基(Gibcol)、成骨誘導培養基(地塞x鬆 10-9M，抗壞血酸鈉 0.2mM，-甘油磷酸鈉 10mM，5%FBS，DMEM-LG 培養基，1%雙抗溶液)、成軟骨誘導培養基(地塞x鬆 10-7M，抗壞血酸鈉0.2mM，丙酮酸鈉1mM，轉化生長因子- 110ng/ml，ITS+LA，DMEM-HG 培養基，2%FBS，1%雙抗溶液)、成脂肪誘導培養基(地塞x鬆 10-7M，吲哚美辛 0.05mM，IBMX0.5mM，2%FBS，DMEM-HG培養基，1%雙抗溶液)、茜素紅 S(Roche)、羊抗牛Ⅱ型膠原多克隆抗體(Southern Biotechno-logy)、番紅 O(Sigma)、油紅 O(Sigma)、TGF- 3(sigma)、BMP-7(sigma)，CD29、CD105、CD166 均購自 eBioScience。新西蘭兔購自上海生旺實驗動物養殖有限公司。
1.2 兔 BMSCs 的分離培養
取2月齡的新西蘭大白兔，雌雄不限，戊巴比妥溶液腹腔麻醉後，常規備皮，消毒，嚴格無菌操作，以骨髓穿刺針接10ml注射器(注射器內含稀釋的肝素鈉 3000U/0.2ml)自脛骨近端內側處行骨髓穿刺術，抽取骨髓液 3ml，緩慢注入預置4ml淋巴細胞分層液的離心管內，進行密度梯度離心。2000rpm 離心 20 分鐘後，吸取中間的單個核細胞層，棄去上清和脂肪，PBS(Phosphate Buffered Saline, 磷酸鹽緩衝液)緩衝液沖洗 2次，再以 1.6×104/cm2的濃度接種於 100mm 培養皿內，加入15ml Ham’s F12 培養液(含青黴素鈉 100U/ml，鏈黴素 100g/ml，兩性黴素B 0.25 g/ml)，加入胎牛血清終濃度爲 10%，置37℃、5%CO2、飽和溼度的條件下培養，於 48 小時後換液，以PBS 沖洗 3 遍，去除全部非貼壁細胞，換上新鮮培養基，同樣環境中繼續培養。以後每 3 日換液一次，待原代培養細胞爬滿培養瓶底時，即可進行傳代。用 0.25%的胰蛋白酶消化 5分鐘後，即可得兔原代骨髓間充質幹細胞懸液。
1.3 兔 BMSCs 表面抗原的鑑定
取生長匯合約 90%的第 3 代細胞，小心吸去培養液，加入 3ml0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液，於 37℃消化約 3 分鐘，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養液 1ml 中止消化，PBS 沖洗兩次，以 1000rpm離心 5 分鐘，棄去上清，加入新鮮培養液製備成細胞懸液，並調整細胞濃度爲 1×106/ml，取 100 l 細胞懸液置於流式管中，按照試劑說明加入抗體，充分混勻後室溫避光放置 30 分鐘，加入流式細胞儀緩衝液1ml混勻後 1000rpm離心 5 分鐘，棄去上清，再加入 0.5ml流式細胞儀緩衝液重懸細胞後，以流式細胞儀進行檢測。
1.4 兔 BMSCs 的'誘導分化
1.4.1 向成骨細胞方向誘導分化
取基本鋪滿瓶底的第3代細胞，胰蛋白酶消化後以2×104/cm2的密度接種於 24 孔板中，加入成骨誘導培養液，每 3 天換液一次，培養 14 天后行茜素紅 S 染色。
1.4.2 向成軟骨細胞方向誘導分化
取基本鋪滿瓶底的第3代細胞，胰蛋白酶消化後洗滌，以2×106/ml 加入 15ml 離心管中以 500rpm 離心 5 分鐘，獲得細胞團塊後置入成軟骨誘導培養基中懸浮培養，每 3 天換液 1次，培養 14 天后行Ⅱ型膠原染色和番紅 O 染色。
1.4.3 向脂肪細胞方向誘導分化
取第3代細胞，胰蛋白酶消化後以2×104/cm2的密度接種於24孔板中，加入成脂肪誘導培養液，每3天換液一次，培養14 天后行油紅 O 染色。
1.5 BMSCs 的誘導分化
根據不同的誘導條件，將獲得的BMSCs 分爲四組：A 空白對照組;B200ng/mLBMP-7單獨誘導組;C15ng/mlTGF- 3單獨誘導組;D TGF- 3 和 BMP-7 聯合誘導組。將四組細胞在37°C、5%CO2孵育箱中培養24小時後更換新鮮培養液，此後每 2 天換液 1 次，連續培養 21 天后收集細胞，用 Trizol 試劑消化裂解，提取細胞中的 mRNA。再用 First Strand cDNASynthesis Kit 將提取的 mRNA 逆轉錄爲 cDNA。以 cDNA 爲模板，進行 Realtime PCR 檢測蛋白聚糖、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原和 SOX9 基因的表達水平。
1.6 統計學處理
採用 SPSS13.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析。先行組間的單因素方差分析(ANOVA)，再以Bonferroni法行兩兩之間的多重比較，<0.05 爲有統計學意義。
2、結果
2.1 兔 BMSCs 培養結果
在光學顯微鏡下，原代細胞接種後，細胞多呈現圓球形，大小不均一，呈散在分佈，懸浮於培養液中，培養 8~10 小時後即可見有體積較大單核細胞逐漸沉降貼壁(圖 1-A)，48 小時後，少量細胞已經貼壁，形態呈圓形或多角形，貼壁的細胞大小不等，形態不一，培養 4 天后大部分細胞呈梭形，部分細胞處於分裂期，細胞數量較開始時明顯增多(圖 1-B)。大約2 周細胞已基本融合，細胞之間相互重疊，細胞排列緊密，細胞大小、形態較爲均一。傳代細胞在培養瓶中均勻分佈後呈貼壁生長，細胞間形態較爲一致，呈紡錘形外觀。
2.2 兔 BMSCs 表面抗原鑑定結果
採用流式細胞計數對第 3 代細胞進行檢測，結果顯示細胞均一性可達90%以上，表面標記物檢測結果如下圖(圖2)。
由結果可知，分離所得的細胞表面可以穩定表達 CD29、CD105 和 CD166 三種骨髓間充質幹細胞最爲特異性的表面標記物，其中 CD29 表達率爲(71.4±3.3)%，CD105 表達率爲(49.3±2.1)%，CD166 表達率爲(88.7±2.7)%。因此可以說明，前期工作中分離培養所獲得的細胞即爲骨髓間充質幹細胞。
2.3 兔 BMSCs 中胚層誘導分化結果
2.3.1 兔 BMSCs 向成骨細胞誘導分化結果
在成骨誘導培養液的誘導分化下，細胞形態在 8 天左右發生不規則改變，呈長梭形、多角形，部分細胞呈卵圓形。誘導 14 天時卵圓形細胞明顯增多，融合緊密。於誘導 14 天時對細胞行茜素紅 S 染色顯示：細胞外基質中有明顯的鈣結節形成。由此可以說明，分離培養的細胞在成骨誘導培養液作用下可向成骨細胞方向分化。
2.3.2 兔 BMSCs 想成軟骨細胞誘導分化結果
在成軟骨細胞培養液的誘導分化條件下，誘導培養早期懸液中的細胞團塊體積呈不規則型，體積有較爲的明顯增大，誘導培養後期細胞團體積無明顯變化，細胞團逐漸變得更加緻密，形狀較早期趨於規則。誘導 21 天時 PBS 洗滌細胞團，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水後石蠟包埋切片，以免疫組織化學方法行II型膠原染色，可見較多量的胞漿中存在黃色顆粒的細胞存在，行番紅O染色可見細胞外基質中存在大量紅染的硫痠軟骨素成分，因此可以說明，分離所得到的細胞在成軟骨培養液誘導環境下可以轉化爲大量表達 II 型膠原的細胞，認爲其能夠在特定條件下向成軟骨細胞轉化。
2.3.3 兔 BMSCs 向脂肪細胞誘導分化結果
在成脂肪細胞培養液的誘導分化條件下，誘導2 天后部分細胞形態開始發生變化，在少數細胞中可見折光性強的脂滴出現，隨着培養時間的延長，細胞中脂滴逐漸增大，含脂滴的細胞數量也逐漸增多。誘導 14 天后對細胞行油紅 O 染色，結果顯示大多數細胞胞質中都有大小不等的被染成紅色的脂滴形成。因此可認爲，在成脂肪細胞培養液誘導分化的條件下，分離所得的細胞可向脂肪細胞方向轉化。
2.4 BMSCs 誘導分化下游基因 Realtime PCR 檢測結果
將四組細胞培養 21 天后，C 組和 D 組的蛋白聚糖、Ⅱ型膠原和SOX9基因的表達水平明顯高於A組和B組(<0.05)，c d="">0.05)，Ⅹ型膠原基因的表達則是A 組和B 組明顯高於C 組和 D 組(<0.05)，而ⅰ型膠原表達四組之間沒有明顯的差異(>0.05)。
3、討論
組織工程中種子細胞的選取非常重要。種子細胞選取的主要原則是：取材方便，來源廣，取材時對機體損傷小;體外培養容易，增殖能力強;細胞特定表達穩定或定向分化能力強，誘導分化可控性高;免疫原性低，植入機體內不產生或產生較低的免疫排斥反應;種子細胞與支架粘附性好，能夠在支架中正常生長及分化。
在組織工程髓核構建中，常用的種子細胞主要分爲椎間盤來源的細胞核椎間盤外來源的細胞。椎間盤來源的細胞主要包括：髓核細胞(nucleuspulposuscells,NPCs)、纖維環細胞(annulus fibrosus cells,AFCs)、脊索源性細胞(notochodalcel-ls, NCs)等，由於這些種子細胞取材造成創傷較大，體外培養存在增殖較慢、表型不穩定及純化、定向分化控制難度高等問題，使其在組織工程髓核構建研究中作爲種子細胞的困難大大增加。
椎間盤外來源的細胞主要有軟骨細胞和多種幹細胞，如骨髓間充質幹細胞(BMSCs)、脂肪幹細胞(Adipose-drivedstem cells,ADSCs)、胚胎幹細胞(embryonic stem cells, ESCs)、人臍帶間充質幹細胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells, HUCMSCs)等。軟骨細胞在體外單層培養中容易出現去分化現象，因此其作爲組織工程髓核種子細胞的可行性還需進一步研究證明。胚胎幹細胞和人臍帶間充質幹細胞獲取較爲困難，且存在複雜的倫理問題。而脂肪幹細胞在體外誘導培養過程中在細胞增殖、定向分化及Ⅱ型膠原和蛋白聚糖等相關蛋白表達上都差於骨髓間充質幹細胞。
BMSCs 主要來源於中胚層，是存在於骨髓中的非造血幹細胞，其在骨髓中的含量一般爲0.001%~0.01%，相對略高於其他幹細胞。雖然 BMSCs 作爲組織工程的種子細胞需要量較大，但其體外培養增殖能力強，並可以多向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞等多種組織細胞分化，甚至有研究認爲，其具有分化成非間充質起源的組織的能力。因此BMSCs 是一種理想的組織工程細胞。
BMSCs 作爲作爲種子細胞，相對於其他細胞來說，具有以下的一些優勢：⑴來源廣泛，BMSCs 雖然隨着機體的衰老而不斷減少，但是存在的 BMSCs 仍能保持良好增殖能力及分化能力，研究顯示老年人的 BMSCs 增殖和分化能力與新生兒和成年人並無明顯差異。獲取方便，操作過程對供體創傷小，常規骨髓穿刺操作獲取的 BMSCs 約有 20%處於靜止期，足夠傳代培養所需的細胞數量。⑵體外培養傳代容易，培養週期短，增殖擴增能力強大，可透過多種分離方法進行分離培養，在經過2~4天潛伏期後開始快速擴增，可穩定的傳至 20~25 代而基本不改變細胞性狀，三代培養後基本可達成人體細胞數量。⑶BMSCs 爲低免疫原性細胞，並不表達B7-1、B7-2、CD40 等共刺激分子，不會激活 T 淋巴細胞，從而避免細胞毒性 T 細胞和 NK 細胞的殺傷作用。⑷BMSCs對於支架的粘附性好。種子細胞與支架的粘附能力對種子細胞增殖和分化能力有着重要的影響。BMSCs 能夠和多種支架材料較好的粘附，給種子細胞生長提供了足夠的空間，使細胞因子更好的分佈於種子細胞周圍，種子細胞表達更加穩定，更利於細胞代謝所需的營養物質的滲入及代謝產物的排出。
Yoo 等研究發現，立體培養的 BMSCs 存在定向軟骨分化，而單層培養則無軟骨形成。BMSCs 有多種分離和體外培養的方法，目前常用的方法主要有四種：全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、免疫磁珠分離法和流式細胞分離法。不同分離方法所獲得的 BMSCs 在分化潛能方面存在一定的差異。後兩種方法是採用抗原抗體反應來對獲取的BMSCs進行分離純化，分離純度高，但是由於目前並未發現 BMSCs 特異性的表面或胞漿內抗原表達，且實驗條件要求高、費用昂貴、對細胞活性可能產生破壞等原因，目前並未得到廣泛的應用。密度梯度離心法雖然能夠獲得較高純度的BMSCs，但是分離過程中可能會對細胞生長的微環境造成一定程度的破壞，分離液也會對細胞造成一定程度的損傷，造成分離得到的BMSCs的克隆擴增時間延長。相比較而言，全骨髓貼壁法操作簡單，BMSCs 貼壁快，數量多，克隆擴增時間早，細胞表型表達穩定等優點。由於目前並未發現 BMSCs 特異性的表面或胞漿內抗原，因此目前對其鑑定主要依賴於其形態學觀察及功能學檢測：⑴體外培養爲貼壁生長的梭形細胞。⑵體外可誘導分化培養成骨、軟骨、脂肪等至少 3 種中胚層細胞。⑶可以表達 CD105、CD29、CD44、CD34、CD166、HLA-DR等多種表型，一般認爲 CD29、CD105 和 CD166 是 MSCs 相對較爲特異的表面粘附分子。
滿足以上要求的細胞方可認爲其爲 MSCs。誘導骨髓間充質幹細胞(BMSCs)需要在適宜的微環境中多種生長因子協同作用。目前已知多種生長因子都具有誘導 BMSCs 想類軟骨和髓核細胞轉化的作用。TGF- 3 就是其中一種，其可有效誘導 BMSCs 的成軟骨轉化。Barry 等發現TGF- 3誘導BMSCs的成軟骨作用明顯強於TGF- 1。
You 等研究表明用 TGF- 3 誘導 MSCs，7 天即出現 II 型膠原表達，21 天后則出現 II 型膠原和蛋白聚糖的共同表達。BMP-7 作爲誘導幹細胞向成骨細胞分化細胞因子的研究較多，Knippenberg等研究則發現，BMP-7 還具有促進AT-MSCs 向軟骨細胞分化的作用。Nishihara 等發現 rhBMP-7可在自體骨表面形成關節軟骨，促進軟骨修復。同時 BMP-7可協同SOX9 維持中胚層軟骨表象分化，從而提高TGF- 3誘導 BMSCs 中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的表達。
本實驗採取骨髓全貼壁法獲得細胞，經細胞形態學觀察爲貼壁的梭形細胞，表達CD29、CD105 和CD166 表面標記，細胞生長增殖能力強，狀態良好。體外可誘導分化成爲中胚層細胞，且操作簡單，誘導分化後的細胞生長良好，增殖正常。
由此可見，全骨髓貼壁法是培養 BMSCs 的快速、簡便、可靠的方法，獲取的BMSCs狀態穩定，使用BMP-7 和TGF- 3 聯合誘導兔 BMSCs 21 天后，細胞的 ACAN、Ⅱ型膠原、SOX9等類軟骨細胞相關基因的表達水平都有明顯的升高，Ⅹ型膠原的表達水平則較空白對照組有明顯的降低，由於Ⅹ型膠原主要由肥大軟骨細胞分泌，爲退變的椎間盤組織中表達量較高的蛋白，SOX9 則爲蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因轉錄過程中的關鍵因子，可以提高二者表達。這也可以說明，在二者聯合誘導環境下，BMSCs 具有向類髓核細胞分化的趨勢，並且可以有效的阻止類軟骨細胞和髓核細胞的退變過程，可作爲組織工程髓核構建中的種子細胞的一個良好的選擇。
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