引言 Introduction
間充質幹細胞是一類起源於中胚層的非造血幹細胞，具有多向分化的潛能，能夠爲細胞治療提供理想的種子細胞，同時也能作爲基因治療的載體細胞，目前已從骨髓、胎盤、脂肪、臍血、臍帶、滑膜等組織器官中分離出間充質幹細胞。體外培養的間充質幹細胞形態均一，平行生長或漩渦狀生長，能夠表達多種表面抗原，如高表達間質細胞標誌(CD44、CD90、CD105)，不表達造血幹細胞標誌(CD34、CD45、CD14)、內皮細胞標誌(CD31、CD33)及人白細胞抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)等。在特定條件下間充質幹細胞可以分化爲成骨細胞、神經細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞及肝細胞等。相比其他間充質幹細胞，本實驗選用的人臍帶間充質幹細胞具有種子細胞的很多優良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無致瘤性等，且來源充足，無倫理問題。現階段用於分離間充質幹細胞的方法主要有以下幾種：貼壁組織塊法、流式細胞儀分選法、膠原酶消化法及其改進方法等。每種方法各有利弊，貼壁組織塊法原代培養時間較長，液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長出細胞的能力，減少了細胞數量，但細胞活性保持良好。流式細胞儀分選法雖然所獲得的細胞純度較高，但實驗成本較大，亦難獲得足夠的細胞數量。普通膠原酶消化法費用較高，雖然可在短時間內獲得細胞，但常溫中消化時間長可能損傷細胞，致使細胞不易貼壁，不易傳代;消化時間短液體較黏稠，難以離心獲得足夠量細胞。胰酶冷消化法曾用於培養乳鼠心肌細胞，與溫胰蛋白酶消化法比較，胰酶冷消化法所需實驗條件簡單，因爲不需攪拌和多次酶消化、清洗的煩瑣過程，胰蛋白酶用量少，節約大量的人力物力，而且冷消化相對細胞活性損傷較輕。本實驗首次採取胰酶冷消化法分離臍帶間充質幹細胞[23]，從細胞形態、生長曲線、細胞表面標記物及誘導分化能力4個方面與傳統組織塊法比較，爲不同需求的科研工作者獲得較多的臍帶間充質幹細胞、更完整的細胞結構及其功能以滿足實驗要求並能達到更節約人力、物力提供一些資料。
1 材料和方法 Materials and methods
設計：對比觀察細胞學實驗。
時間及地點：實驗於2013年6月至2014年3月在新疆醫科大學幹細胞研究室完成。
材料：足月健康新生兒臍帶組織取自新疆醫科大學第五附屬醫院婦產科，產婦及家屬均知情同意，採集後裝於盛有無菌生理鹽水的50 mL離心管中，4 h內處理。
實驗方法：
臍帶間充質幹細胞的原代培養：胰酶冷消化法：取足月健康新生兒臍帶組織，剔除組織中的血管，用PBS反覆沖洗去除血跡，剪碎至大小約1 mm3，放入50 mL離心管中，加入PBS離心(1 200 r/min)5 min，洗滌3遍，之後取離心後的組織塊放入培養皿中並加入稀釋後的胰酶(PBS與胰酶同比例混合)10 mL，用封口膜封死培養皿邊緣，放入4 ℃冰箱過夜。第2天取出培養皿中的`組織於50 mL離心管中，放入37 ℃水浴箱中15 min，之後加入L-DMEM用巴氏管充分吹打，靜置1 min待組織塊沉底後吸取上清液於15 mL離心管中。上述步驟重複操作2遍，儘量收集上清液，加入15 mL離心管離心(1 200 r/min)10 min，去除上清液加入含體積分數爲20%胎牛血清培養液。混勻後加入培養皿中，放入37 ℃、體積分數爲5%CO2及飽和溼度條件下培養，每3 d換液1次。培養14 d左右，當細胞達到大部分融合時，用胰酶消化傳代，並將組織轉移到一個新的培養皿中，按上述方法繼續培養。組織塊培養法：取足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS洗滌數遍，去除殘留血跡。把臍帶剪切成4.0 cm左右的片段並剔除血管(1條臍靜脈，2條臍動脈)，之後將其剪成大小約1 mm3的組織塊，然後平攤置於55 mm培養皿中並加入2 mL胎牛血清加以固定。2 h後，按比例加入含有青鏈黴素、谷氨醯胺、維生素C及碳酸氫鈉的L-DMEM培養基約8 mL，放置在37 ℃、體積分數爲5%CO2培養箱中培養。每隔3 d半換液1次。觀察貼壁組織周圍的細胞生長情況，當細胞達到80%-90%融合度時，用胰酶消化傳代，並將組織轉移到一個新的培養皿中，按上述方法繼續培養。
臍帶間充質幹細胞的生物學特性：細胞形態：兩種方法培養的原代細胞透過普通倒置顯微鏡觀察其形態變化。生長曲線：取上述兩組第2代臍帶間充質幹細胞以每孔5×103/cm2的濃度接種於24孔板中。採用胰酶消化錐蟲藍染色法，每日取4孔計數細胞，繪製細胞生長曲線，細胞達到生長抑制時停止實驗。流式細胞儀檢測細胞表面標記特徵：胰蛋白酶消化第3代臍帶間充質幹細胞，1 200 r/min離心5 min，細胞重懸。調整細胞濃度爲1×106 L-1，與抗CD29，CD34，CD45，CD105單克隆抗體室溫反應30 min，PBS洗滌2次後，與FITC或PE標記的二抗避光作用30 min，將洗滌後的細胞重懸於PBS中，待測。誘導臍帶間充質幹細胞分化爲神經幹細胞：取傳至第3代的臍帶間充質幹細胞，置於誘導培養基(含2%B27、20 μg/L鹼性成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12培養基)中培養，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化。取誘導第3天的臍帶間充質幹細胞，行熒光免疫化學檢測，細胞爬片在室溫下用40 g/L多聚甲醛固定，經PBS預清洗，血清封閉，滴加兔抗人神經巢蛋白抗體(1∶400)，置溼盒中4 ℃下過夜。加入Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG抗體(1∶200)，37 ℃下孵育0.5 h。以PBS作爲陰性對照。
主要觀察指標：①兩種方法培養的原代臍帶間充質幹細胞最早出現時間及培養週期。②兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞的形態。③兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞的生長曲線。④兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞的細胞表面標記特徵。⑤兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞向神經幹細胞多向分化的潛能。
統計學分析：用SPSS 17.0統計學軟件處理，做t 檢驗，P < 0.05爲差異有顯著性意義。
2 結果 Results
2.1 兩種方法培養的原代臍帶間充質幹細胞最早出現時間及培養週期
使用上述兩種方法均可獲得人臍帶間充質幹細胞，組織塊法在種植後第5-7天才見到細胞從組織塊爬出，最早觀察細胞貼壁時間爲(5.80±0.84) d，而胰酶冷消化法在消化種植後第2，3天就可見到細胞貼壁生長，最早觀察細胞貼壁時間爲(2.60±0.55) d，差異有顯著性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的原代細胞達到90%-95%融合的時間差異無顯著性意義(P > 0.05)，組織塊法爲(14.4±1.67) d，胰酶冷消化法爲(14.6±0.90) d。
2.2 兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞形態觀察及生長情況
胰酶冷消化法培養兩三天就可見單個貼壁細胞，呈圓形或短梭形，培養10 d左右，細胞形態逐漸伸展開來，大體呈長梭形，但少數細胞邊緣不光滑，爲多角形，不規則，細胞的體積較大，培養2周之後，細胞已逐漸形成漩渦狀的集落，且逐漸變大，細胞增多，即可傳代。傳代後的細胞生長速度明顯增快，數量增多，四五天即可傳代1次。組織塊法培養5 d左右亦可觀察到個別細胞沿組織塊邊緣爬出，呈短梭形、纖細;隨後細胞數量增多，慢慢向外擴長，形態類似成纖維細胞，並逐漸形成漩渦狀的集落，培養13-16 d，可見細胞集落逐漸變大，細胞增多，即可傳代。
2.3 第3代人臍帶間充質幹細胞的生長曲線
兩組細胞的增殖曲線近似“S”型，細胞種植後第一二天處於潛伏期，從第3天起細胞開始進入對數增殖期，於第8天左右進入平臺期;組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著快於胰酶冷消化法，在進入對數生長期後的各個時間點細胞數量差異有顯著性意義(P < 0.05)。
2.4 兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞表面抗原檢測
爲了明確臍帶來源貼壁生長細胞是否與骨髓間充質幹細胞具有相同的抗原標誌表達，取上述第3代臍帶間充質幹細胞樣細胞經流式細胞儀檢測，結果顯示，上述細胞不表達CD34，CD45，而表達CD29、CD105，即表達了骨髓間充質幹細胞的常見抗原標誌。
2.5 兩種方法培養的臍帶間充質幹細胞向神經幹細胞多向分化的潛能
兩種方法培養出來的第3代人臍帶間充質幹細胞加入誘導液後第2天均可看到部分細胞聚集成團漂浮於誘導液當中，呈橢圓形或圓形，隨着誘導時間增長，漂浮的神經球樣細胞越來越多，且越來越大，免疫熒光顯示神經球樣細胞表達神經幹細胞特徵性標誌物nestin陽性。
3 討論 Discussion
臍帶是聯繫胎兒與胎盤的一種管狀結構，在胎兒正常分娩時被當作廢棄物丟棄。故利用臍帶來分離擴增間充質幹細胞屬於變廢爲寶，幾乎不涉及倫理道德問題，易於收集，不易污染，可以在短時間內獲得足夠數量的細胞;其次，臍帶間充質幹細胞比較原始，分化、增殖分化能力強，生物活性穩定，而骨髓間充質幹細胞在骨髓內含量較少且增殖能力隨着年齡的增長而顯著下降，故易受到供者年齡的限制。Weiss等也透過CFU-F培養法檢測顯示臍帶中間充質幹細胞含量明顯多於骨髓液。因此臍帶間充質幹細胞以其獨特的優點，逐漸成爲幹細胞中最具有應用前景的種子細胞。
本實驗使用上述兩種方法均可獲得臍帶間充質幹細胞，組織塊法在種植後第5-7天才見到細胞從組織塊爬出，而胰酶冷消化法在消化種植後兩三天就可見到細胞貼壁生長，差異有顯著性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的細胞達到90%-95%融合的時間差異無顯著性意義(P > 0.05)，鏡下可見細胞均爲貼壁生長，呈成纖維細胞樣，但胰酶冷消化法培養的少數細胞呈多角形，不規則，細胞的體積較組織塊法大。組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著快於胰酶冷消化法，在進入對數生長期後的各個時間點細胞數量差異有顯著性意義(P < 0.05)，提示冷消化法對原代的臍帶間充質幹細胞有損害作用。兩種方法獲得的細胞經3代以上培養，均呈現長梭形貼壁形態，與骨髓間充質幹細胞爲金標準一樣，具有與其相同的表面標誌，如表達CD29、CD105，不表達CD34、CD45，具有間充質幹細胞的特性。臍帶間充質幹細胞經誘導後呈現神經球樣形態，漂浮於誘導液當中，表達神經幹細胞特異性標誌——nestin蛋白;進一步將這些細胞球分離成單細胞懸液，繼續傳代培養，發現單個的細胞又很快變成類似原代培養時出現的島嶼狀細胞球，充分顯示了神經幹細胞有別於一般神經細胞的增殖特性，說明人臍帶間充質幹細胞在特定的培養液中具備形成神經幹細胞的潛力和特性;實驗中所採用的培養條件可以保證神經幹細胞的生成與存活環境，有人把神經球繼續誘導可以表達NSE、GFAP、NF-M、S100、Tubulin等神經元或神經膠質特異性表達標誌物，爲將來以誘導人臍帶間充質幹細胞成神經幹細胞作爲種子細胞進行體內移植治療脊髓損傷提供了實驗依據。
實驗結果顯示：胰酶冷消化法與組織塊法均能培養出人臍帶間充質幹細胞，具有相同的表面標誌及誘導成神經幹細胞的能力。組織塊法的優點：簡單易行，無需放入4 ℃冰箱過夜，操作時間短，而且原代培養時間也與酶消化法無明顯差異，細胞形態保持良好的長梭形，此法對細胞無明顯損害，細胞活性較冷消化法強。缺點：液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長出細胞的能力，減少了細胞數量。胰酶冷消化法透過研究僅原代細胞爬出時間較組織塊法早，其他無明顯優勢，故胰酶冷消化法雖然可以同樣培養出人臍帶間充質幹細胞，但並沒有想象中有那麼多優點，相對而言操作變得煩瑣且時間長，細胞形態也受到損害。故對於培養人臍帶間充幹細胞，組織塊法要優於胰酶冷消化法。