【論文關鍵詞】青黴素結合蛋白 金黃色葡萄球菌 綠膿桿菌; 細菌細胞壁 病原菌 點結合 大腸桿菌
【論文摘要】β-內酰胺抗生素(如青黴素類和頭孢菌素類等)可以專一性與細菌細胞膜上的靶位點結合,干擾細胞壁肽聚糖合成而導致細胞死亡。由於靶位點能與同位素標記的青黴素G進行共價結合,因此將這些靶位點稱之爲青黴素結合蛋白(Penicillin binding pro-teins,PBP’s)。一些革藍氏陰性細菌和少數革藍氏陽性菌能夠產生多種β-內酰胺酶,這些酶可以水解青黴素和頭孢菌素等抗生素,而使細胞具有抵抗這類β-內酰胺抗生素的殺傷能力。已經證明β-內酰胺酶產生與質粒和染色體基因有關。對於不產生β-內酰胺
β-內酸胺抗生素(如青黴素類和頭抱菌素類等)可以專一性與細菌細胞膜上的靶位點結合，干擾細胞壁膚聚糖合成而導致細胞死亡。由於靶位點能與同位素標記的青黴素G進行共價結合，因此將這些靶位點稱之爲青黴素結合蛋白(penieillinbindsng pro-teins，PBP’s)。一些革藍氏陰性細菌和少數革藍氏陽性菌能夠產生多種β一內酞胺酶，這些酶可以水解青黴素和頭抱菌素等抗生素，而使細胞具有抵抗這類β一內酞胺抗生素的殺傷能力。已經證明β一內酞胺酶產生與質粒和染色體基因有關。對於不產生莊內酞胺酶的細菌而言，獲得刀一內酞胺抗性的能力是透過改變抗生素作用的靶位點，其結果或者減少PBP’5的數量或者降低PBP‘s對物的親和力。這種不依賴刀一內酞胺酶而存在的莊內酞胺抗性廣泛存在於人類病原菌中，而絕大多數這類病原菌是從經過刀一內酞胺藥物治療過的病人中分離出來的，如許多分離到的綠膿桿菌〔1〕、金黃色葡萄球菌〔2-3〕、流感嗜血桿菌(4-5)、肺炎鏈球菌(6-7)、淋球菌臨(8-9)、屎鏈球菌(10-11)等均具有內在的β-內酚胺抗性。由於臨牀上越來越多地分離到月耐藥性細菌，對於β一內酞胺抗生素的:使用目困.提出了挑戰，有關細菌對β一內酞胺藥物抗性機理的研究也就越來越多地引起人們的重視，這種研究對發展新一代抗生素更有效地用於臨牀治療具有重要意義。本文主要介紹細菌內在的口一內酞胺抗性機理研究進展。
一、PBp’S的生物學特性
早在1940年Gardner在觀察青黴素G對敏感細菌作用時發現細胞壁是β-內酞胺抗生素最初攻擊的靶位點，因爲青黴素G的作用首先是削弱細胞壁的功能。後來進一步證實莊內酸胺抗生素首先與細胞膜上的PBP產S結合，這些PBP’s具有酶活性，參與細菌細胞壁膚聚糖的合成。膚聚糖主要負責維持細菌細胞壁的完整性，生長在低滲中的細菌如該結構破壞會導致細胞死亡。β一內酞胺抗生素與PBP’S結合，干擾了PBP’s的正常酶功能，使細胞壁正常合成阻斷。所有檢測的真細菌種至少含有3種PBP’S，有些含有8一9種。有關PBP侶的命名後面將要介紹。對大腸桿菌的PBP尹S研究得最清楚(12.13.14)。在大腸桿菌中有7種PBP’S，依次爲PBPIA、IB產S、2、3、4、5、6。這7個PBP’S分別受控於10個不同的染色體遺傳位點。ponA或mrcA決定PBPIA;ponB或mreB控制IB’S;pbpA或mrdA與
PBP2產生有關;pbpB或ftsl編碼PBPs;dacB、dacA、dacC三個遺傳位點分別控制PBP4、5、6。PBPIA分子量92KDa，PBPIB’C由一系列分子量在90KDa範圍的蛋白質組成。PBPIA和IB p在體外兼具有轉葡糖基酶和轉膚基酶活性，這二種酶在細菌細胞壁合成中起重要作用，如果PBPIA和IB;S同時失活則導致細胞快速裂解死亡。PBP2分子量爲66KDa，在間隔區(septa)細胞壁合成時具有轉膚基酶活性，PBPZ失活，細胞變成球形體不生長。PBP3的分子量爲60KDa，在IBgl隔區橫壁(eross一wall)合成時有轉葡糖基酶或(和)轉膚基酶活性。PBP3突變細胞變成無隔膜的絲狀體。PBP4分子量49KDa，具有次級的轉膚基酶、D、D一竣膚酶或D、D一內膚酶活性，在膚聚糖成熟中起作用。PBP4變性導致細胞不能持續轉膚作用。PBPS和6均具有D、D一狡膚酶活性，目前尚未觀察到對於這二個蛋白質變性引起的細菌生理生化反應。除上述發現的7種PBP’S外，用碘代青黴素衍生物又檢測到一種新的PBP’s，命名爲PBPIC，有關大腸桿菌PBPIC的特點及功能還不清楚(15)。
同時抑制PBP工A與任何一種PBP]B’S，PBPZ或PBP3均導致生長的大腸桿菌細胞死亡。所有這些高分子量PBP’S均具有體外轉膚基酶活性，除PBP2外，其它均具有轉葡糖基酶活性，很明顯，所有這些PBP’s在大腸桿菌細胞壁或橫壁合成的催化控制中起重要作用，它們是獨立的刀一內酞胺抗生素殺傷靶位點。
二、pBP’S分離及純化
每個大腸桿菌細胞約含105~104個PBP’S分子，共分成二類，一類爲含量豐富的低分子量PBP/s，具有D、D一撥膚酶活性，由於含量豐富，這類PBP’s很容易純化。第二類由一些含量較少的高分子量PBP’S組成，純化比較困難，而且純化的PBP’s在體外常常檢測不到酶活性。
早期用〔)青黴素標記敏感細菌時發現，青黴素與細胞膜上少數高親和力PBP’s形成的複合物在2%SDS、酚水溶液或沸水中可以保持穩定，而且既便有過剩的非標記β一內酞胺藥物存在時也不與標記的青黴素發生取代。PBP’s能與青黴素衍生物進行共價結合的特性使得人們能用親和層析方法分離純化這些蛋白質，洗脫劑用經胺，因爲經胺是轉膚基作用的受體，用這種方法可以純化活性pBP’S
Spratt和Pardee(16)發明一種簡單可重複性技術用於PBP’s分離。首先用〔〕一青黴素標記膜製備物，並使之飽和，然後用離子去污劑使之變性(主要防止青黴素一PBP複合物被酶水解)。用SDS聚丙烯酷胺凝膠電泳分離各PBP產s，根據分子量的遞減或者在SDS一中泳動速率遞增命名爲，PBPI、2…n。各種細菌的PBP’s均用此法命名，亞類可用A、B、C等。如PBPI又分爲PBP一A、1B和1C。
在膜製備過程中有必要保留PBP’s活性。需要說明的是，其它的β一內酞胺抗生素如甲氧西林(methieillim)、頭抱西丁(Cef-oxitin)、氨葦青黴素以及moxalaetan等也可與膜蛋白結合，但所有的β一內酸胺抗生素的靶位點均位於PBP/s之間，尚未發現一種只與上述抗生素結合而不與青黴素結合的膜蛋白。另外實驗表明，在分離PBP’s時，用〔〕一青黴素進行體外標記比〔〕升青黴素專一性更高。
三、革藍氏陽性細菌PBP‘S改變與細菌內在β一內酞胺抗性關係
一般講，革藍氏陽性細菌細胞壁可自由透過β一內酞胺抗生素，除產生β一內酞胺酶菌株，革藍氏陽性菌一般對青黴素敏感。目前產生β一內酞胺酶的菌株在革藍氏陽性菌中主要是葡萄球菌，幾乎所有的金黃色葡萄球菌都產生β一內酞胺酶。由於葡萄球菌產生β-內酞胺酶，臨牀上曾採用甲氧西林取代青黴素，但使用不久就分離到抗甲氧西林的突變株。從英國、美國、意大利、澳大利亞、日本等國分離到的抗甲氧西林金黃色葡萄球菌突變株均發現含有一個共同的但在正常敏感菌株中不存在的PBP，命名爲PBP2’ (或PBP2a)(17)，分子量約7sKD。，該蛋白質對廣譜房內酞胺抗生素均具有較低的親和力。該PBPZ‘在SDS一page中位於野生型PBPZ和3之間。
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