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【摘要】目的 闡明梔子Gardenia jasminoides Ellis中抗急性淋巴細胞白血病的活性成分。方法 用色譜方法分離梔子中化學成分，用波譜技術(IR，ESI?MS，1H?NMR，13C?NMR)進行結構鑑定，用四唑鹽(MTT)比色法測定化合物對白血病細胞（HL?60?人早幼粒細胞白血病、REH?人急性淋巴細胞白血病、 Raji?淋巴瘤）增殖的影響。結果 分離鑑定了8個化合物：β?谷甾醇（1），5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），梔子苷（5），去乙酰車葉草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龍膽苷（7），雞矢藤次苷甲酯（8）。化合物3對3種白血病細胞增殖均表現出了一定的抑制作用，其中對REH細胞系抑制活性最強，IC50爲7.5 μg/mL。結論 化合物3具有抗急性淋巴細胞白血病的作用。
【關鍵詞】 梔子 急性淋巴細胞白血病 活性成分 四唑鹽比色法
Abstract:Objective To determine the active constituents from Gardenia jasminoides against acute lymphoblastic leukemia. Methods Compounds were isolated and purified by various column chromatographic techniques and their structures were elucidated on the basis of spectral analysis (IR, ESI?MS, 1H?NMR, 13C?NMR). The inhibitory activity against the proliferation of HL?60, REH and Raji cell lines was determined by using MTT assay．Results Eight compounds were isolated and identified as β?sitosterol (1)，5?hydroxy?7，3′，4′，5′?tetramethoxyflavone (2)，Ursolic acid (3), D?mannitol (4)，geniposide (5), deacetylasperulosidic acid methyl ester(6), genipin?1?β?gentiobioside (7) and scandoside methyl ester (8). Compound 3 exhibited inhibitory effects on leukemic cell proliferation in vitro with IC50 of 12.2, 7.5 and 15.4 μg/mL aginst HL?60, REH and Raji cell lines, respectively．Conclusion Ursolic acid might be one of the active ingredients against anti-acute lymphoblastic leukemia conferred by Gardenia jasminoides Ellis.
Key words:Gardenia jasminoides Ellis；acute lymphoblastic leukemia；active constituents；MTT assay
1），5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），梔子苷（5），去乙酰車葉草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龍膽苷（7），雞矢藤次苷甲酯（8），其中熊果酸對白血病細胞增殖表現較強的抑制作用。
1 儀器與材料
Fisher?Johns熔點儀（未校正），SHIMADZU FTIR?8400S紅外光譜儀，Bruker AM 500型核磁共振儀， Thermo Scientific LTQ Orbitrap質譜儀，上海亞榮旋轉蒸發儀RE 2000，SpectraMax 190酶標儀(美國Molecular Devices公司)，薄層板和硅膠（青島海洋化工廠），Sephadex LH?20爲Pharmacia產品，其他試劑均爲分析純（MTT,美國Sigma公司）。
細胞株：HL?60?人早幼粒細胞白血病、REH?人急性淋巴細胞白血病、Raji?淋巴瘤（北京協和醫學院/中國醫學科學院基礎醫學研究所）
梔子樣品於2008年3月購自北京同仁堂京北康大家園藥店，經林餘霖研究員鑑定爲梔子Gardenia jasminoides Ellis。植物標本存放於中國醫學科學院藥用植物研究所標本館，編號爲R?001。
2 方法
2．1 提取與分離
焦梔子（1 kg）經過粉碎，用體積分數95%乙醇迴流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮得浸膏100 g，稱取硅膠(100～200目)210 g拌樣，上硅膠色譜柱,用三氯甲烷?甲醇（體積比100∶1～0∶100）洗脫：三氯甲烷?甲醇（體積比95∶5）洗脫部分可得到化合物1（15 mg）、化合物2（6 mg）、化合物3（18 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比9∶1～8∶2）洗脫得化合物5（1 853 mg）、化合物6（9 mg）、化合物7（8 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比7∶3）洗脫得到化合物8（10 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比6∶4）洗脫得到化合物4（120 mg）。
2.2 活性篩選
粗提物、各組分及化合物以二甲基亞碸（DMSO）溶解，配成50 mg·mL-1的儲備液，-20 ℃儲存。臨用時用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI?1640培養液稀釋，配製所需濃度（終濃度樣品中DMSO含量<0.1%）。取對數生長期的腫瘤細胞2×105個/mL，接種於96孔培養板,每孔100 μL,設不同濃度的細胞組、空白對照組、調零組，至終體積爲200 μL，每組設6個復孔。接種後，於37 ℃、5% CO2中進行培養。培養48 h後，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，孵育4 h後，1 000 r/min離心5 min,小心吸棄培養液，加入DMSO 150 μL，振盪10 min，充分溶解MTT。酶標儀測定各孔吸光度（A值），其中測定波長爲570 nm，校正波長爲650 nm。計算生長抑制率。
生長抑制率=給藥組A值-調零組A值細胞空白對照組A值-調零組A值×100%3 結果與討論
3．1 結構鑑定
化合物1:無色片狀晶體（三氯甲烷），mp 142～143 ℃。EI?MS m/z：414(M+)，與文獻［3］報道數據一致；與對照品β?谷甾醇共薄層層析，兩者的Rf值、斑點顏色完全一致。鑑定爲β?谷甾醇。
化合物2:無色針晶(石油醚)，1H?NMR(500 MHz，CDCl3) δ：3.96［6H，s，(CH3)2 C3′, C5′?OCH3］，3.93(3H，s，C7?OCH3)，3.89(3H，s，C4′?OCH3), 6.38(1H，d，C8?H)，6.50(1H，d， C6?H)，6.60(1H，br s， C3?H)，7.08(2H，s，C2′?H，C6′?H)，12.72(1H，br s，C5?OH)。以上數據與文獻［4］報道一致，確定爲5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮。
化合物3: 白色結晶，mp 269～270 ℃。13C?NMR(DMSO?d6)δ: 38.3(C?1)，23.7(C?2)，76.7(C?3)，38.3(C?4)，52.3(C?5)，21.0(C?6)，32.6(C?7)，38.4(C?8)，46.7(C?9)，38.1(C?10)，24.0(C?11)，124.5(C?12)，138.1(C?13)，41.6(C?14)，30.1(C?15)，21.0(C?16)，46.9(C?17)，54.7(C?18)，28.2(C?19)，27.5(C?20)，26.9(C?21)，36.2(C?22)，22.8(C?23)，16.9(C?24)，16.0(C?25)，15.1(C?26)，23.7(C?27)，178.2(C?28)，21.2(C?29)，23.2(C?30)。上述數據與文獻［5］報道一致，與標準品進行薄層層析對照，Rf值一致，鑑定爲熊果酸。
化合物4:無色針狀結晶，mp 167 ℃。ESI?MS m/z： 181［M?H］-。 IR (KBr)cm-1： 3 260， 2 940，
1 470，1 105，1 030。以上數據與文獻［6］報道一致。13C?NMR(DMSO?d6) δ：71.3(C?2,5)，69.6(C?3,4)，63.8(C?1,6),綜上所述鑑定爲D?甘露醇。
化合物5: 白色粉末(三氯甲烷)，mp 163～164 ℃。ESI?MS m/z：411［M+Na］+。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6 ) δ：7.45(1H，s，H?3)，5.66(1H，brs， H?7)，5.11(1H，d，J=6.8Hz，H?1)，3.66(3H，s，COOCH3),4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上數據與文獻［4］報道一致，確定爲梔子苷。
化合物6: 無色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：427 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6) δ：7.56(s，H?3)， 5.87(s，H?7)，4.92(d，J=8.5 Hz,H?1)，4.56(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.27(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′ )。以上數據與文獻［6,8］報道基本一致，鑑定爲去乙酰車葉草苷酸甲酯。
化合物7:無色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：573 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.46(s，H?3)， 5.69(s，H?7)，5.11 (d,J=5.5 Hz,H?1),5.0(d，J=7 Hz，H?1′)，4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上數據與文獻［7］報道基本一致，鑑定爲京尼平?1?β?龍膽苷。
化合物8:無色粉末（甲醇）。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.35(s，H?3)， 5.64(s，H?7)，5.27(d，H?1)，4.45(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.11(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′)。以上數據與文獻［6,8］報道基本一致，鑑定爲雞矢藤次苷甲酯。
3.2 活性篩選結果
活性篩選結果（見表1）顯示，化合物3(熊果酸) 對3種白血病細胞增殖均表現出了一定的抑制作用，其中對REH細胞系抑制活性最強，IC50爲7.5 μg/mL。
表1 化合物對3種白血病細胞增殖的抑制作用（略）
Table 1 IC50 (50%Inhibitory concentration) of compounds from Gardenia jasminoides Ellis against three different leukemic cell linesIC50/
有關熊果酸對急性淋巴細胞白血病細胞的抑制作用此前未見文獻報道。本文結果表明，梔子提取物中抑制細胞增殖的活性成分主要在低極性部位，水溶性部分沒有顯示細胞抑制作用。在分離的得到的化合物中，三萜類成分熊果酸顯示出了較強的體外活性，對3種白血病細胞均有一定的抑制作用，尤其對急性淋巴細胞白血病REH細胞株有較強的.抑制作用；而其他化合物均沒有細胞抑制作用（IC50值大於160 μg·mL-1）。
民間治療急性淋巴細胞白血病通常是取30～40個焦梔子加水煎湯。30～40個梔子大約25～35 g，熊果酸在梔子中的質量分數約爲0.03%～0.04%［9］，相當於約100 mg左右熊果酸的用量，這一用量可在體內一定程度上達到抑制白血病細胞增殖的起效劑量。因此，熊果酸可能爲梔子治療急性淋巴細胞白血病的一個活性成分。當然，梔子中其他成分在治療急性淋巴細胞白血病中發揮的作用及其機制可能也不可忽略，例如雖然本文中水溶性部分沒有顯示直接的抑制白血病細胞增殖的活性，但文獻研究發現梔子多糖具有比較廣譜的體內抑瘤效應［11-12］，梔子中環烯醚萜有機酸酯類成分具有抗氧化和抗炎活性［12］，這些活性作用可能對急性淋巴細胞白血病的治療也發揮一定的輔助作用。
【參考文獻】
［1］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部［M］ ．北京：化學工業出版社，2005：173.
［2］ 賈堃．中醫癌瘤學［M］ ．西安：陝西科學技術出版社，1996：374.
［3］ 國家醫藥管理局中草藥情報中心站．植物藥有效成分手冊［M］ ．北京：人民衛生出版社，1986：968.
［4］ 陳紅，肖永慶，李麗,等．梔子化學成分研究［J］ ．中國中藥雜誌,2007,32(11)：1041.
［5］ 斯建勇，陳迪華，潘瑞樂,等．白花蛇舌草的化學成分研究［J］ ．天然產物研究與開發,2006,18(6)：942.
［6］ 王鋼力，趙淑傑，陳德昌．大黃梔子果實化學成分的研究［J］ ．中國中藥雜誌 1999,24(1)：38.
［7］ 李霄，石任兵，劉斌,等．清腦宣竅方有效部位的化學成分研究［J］ ．北京中醫藥大學學報,2005,28(2) ：70.
［8］ 蘇保寧，賈忠建．利用波譜技術確定環烯醚甙的結構［J］．蘭州大學學報：自然科學版,2000,36(1)：58.
［9］ 樑迎．高效液相色譜法測定梔子及其炮製品中熊果酸的含量［J］ ．廣東藥學,2003,13(3)：2
［10］ 孟延發，劉景會，李志孝,等．梔子多糖的分離純化及其基本性質［J］ ．蘭州大學學報:自然科學版,1993，29(2)：109.
［11］ 石若夫，李大力，田春宇,等．梔子多糖的抗腫瘤活性研究［J］ ．林產化學與工業,2002,22(4)：67.
［12］ 那莎，郭國田，王宗殿,等．梔子及其有效成分藥理研究進展［J］ ．中國中醫藥資訊雜誌,2005,12(1)：90.