題目：紅芪多糖的純化及初步結構鑑定
論文摘要：目的研究紅芪多糖的分離純化及初步的結構。方法採用超聲輔助提取多糖，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的效果，並用 GC、TLC及 IR分析多糖的初步結構。結果三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，經 Sephadex G-25柱層析分離純化後得紅芪多糖2(HPS-2)，HPLC確定爲均一多糖，糖含量爲 98.2%，糖組成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比爲 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。結論HPS-2是一種以 β苷鍵爲主的吡喃型雜多糖。
論文關鍵詞：紅芪多糖; 薄層色譜; 結構鑑定
紅芪(Radix Hedysari)，爲豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的乾燥根，爲甘肅特產名貴藥材，在臨牀上主要用於補氣固表， 利尿託毒， 排膿， 斂瘡生肌。紅芪中含有氨基酸、有機酸、β-谷甾醇、紅芪多糖、微量元素等衆多的生物活性物質[1]。近年來研究發現，紅芪多糖的活性成分具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、治療糖尿病等作用[1，2]。特別是我們近幾年的研究發現，經 7%乙醇沉澱部分藥理作用尤爲明顯。由於多糖爲大分子化合物，分離純化比較困難，而蛋白質的脫除是後期結構鑑定的關鍵之一，爲了提高多糖的得率、純度及活性，本實驗對這部分多糖進行了脫蛋白方法的研究，結合TLC、GC、IR等方法對 HPS-2 的結構進行了初步的分析，以期爲紅芪多糖的進一步研究提供理論基礎。
1 材料與儀器
紅芪，購自甘肅武都;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍 G-25(西安周鼎國生物技術有限責任公司);單糖對照品(中國藥品生物製品檢定所);Sephadex G-25(上海長征製藥廠);硅膠 G(青島海洋化工廠);其它試劑均爲分析純。
CR22G Ⅱ型離心機(日本日立);UV-17 型紫外儀(日本島津);GC-Clarus 5型氣相色譜儀(美國 PerkinElmer公司);紅外光譜儀(Nicolet NEXUS 67);BS-1A 自動部分收集器、HL-2 恆流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司);美國Waters6型高效液相色譜儀，配 Waters2414型示差折光檢測器。
2 方法
2.1 紅芪多糖的提取純化路線其流程如下。
2.1.1 提取紅芪藥材→粉碎→超聲脫脂→熱水提取3次→合併提取液→減壓濃縮後離心→取上清液→乙醇沉澱→有機溶劑洗劑→透析→減壓濃縮→冷凍乾燥得粗多糖 HPS。
2.1.2 純化粗多糖液→脫蛋白、色素→Sephadex G-25柱層析→洗脫液透析→濃縮→冷凍乾燥→精製紅芪多糖 HPS-2。
2.2 蛋白質和多糖含量的測定蛋白質含量測定採用考馬氏亮藍法[3]，多糖含量採用苯酚-硫酸法[4]。
2.3 脫蛋白方法
稱取一定量的粗多糖，加入適量蒸餾水，6℃加熱溶解，備用。本實驗採用 3種脫蛋白的方法。
2.3.1 Sevag法取粗多糖溶液，加入等體積的氯仿-正丁醇(V/V爲 4∶1)試劑，混合振搖 3 min，離心除去沉澱，透析後醇沉，冷凍乾燥，即得脫蛋白多糖。
2.3.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液體積 .1倍量的三氯乙酸，低溫(4℃)劇烈振搖 3 min，離心除去沉澱，透析後醇沉，冷凍乾燥，即得脫蛋白多糖。
2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法
取粗多糖溶液，加入等體積的三氯乙酸-正丁醇(V/V爲 1∶1)試劑，振盪 1 min，靜置分層，收集下層水溶液，透析後醇沉，冷凍乾燥，即得脫蛋白多糖。
2.4 紅芪多糖的精製將一定量的脫蛋白多糖，溶解於適量蒸餾水中。過氧化氫除色素，減壓濃縮，經醇沉、離心、冷凍乾燥得紅芪多糖1(HPS-1)，取適量的 HPS-1，蒸餾水溶解後，Sephadex G-25柱分離，蒸餾水洗脫，流速 .8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，繪製洗脫曲線，合併主峯流出液，減壓濃縮至一定體積，冷凍乾燥得 HPS-2。
2.5 純度鑑定用 HPLC法，TSK-gel G25PW色譜柱，示差折光檢測器，流動相爲雙蒸水，流速 1. ml/min，檢測器溫度35℃，樣品濃度4 mg/ml，進樣量5 μl。同時取該樣品溶液在 2～4 nm範圍內進行紫外掃描。
2.6 氣相色譜參照文獻[5]，多糖樣品經徹底水解後製備糖腈乙酸酯衍生物，以單糖的糖腈乙酸酯衍生物爲對照品進行 GC分析。色譜條件: OV-11毛細管柱(5 m×. 32 mm)，載氣爲N2 ，流速 5 ml/min，分流比 4∶1，FID氫火焰檢測器，汽化室溫度 25℃，檢測器溫度 28℃。程序升溫:11℃(保持 5 min)→(5℃/min)→ 28 ℃(保持 2 min)。進樣量 .4 μl。
2.7 薄層色譜[6]取 15mg HPS-2，三氟醋酸徹底水解，水解產物溶於 1 ml蒸餾水中，以標準單糖爲對照，分別取樣品水解液和單糖對照液在含磷酸二氫鈉的硅膠G薄層板上點樣，上行二次展開，展開劑: 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V);自然風乾後顯色，顯色劑: 苯胺-鄰苯二甲酸溶液，烘箱中 15 ℃加熱 5～1 min顯色。
2.8 紅外光譜測定 取 2 mg HPS-3，KBr壓片，測定紅外光譜。
3 結果
3.1 脫蛋白方法的選擇以蛋白脫除率和多糖損失率爲指標，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白效果(見圖1)。Sevag法的多糖損失率最低，但脫蛋白率也最低;三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白率最高，多糖損失率最低;三氯乙酸法的脫蛋白率達 3%以上，但多糖損失最高。綜合各方面的因素，本實驗選取三氯乙酸-正丁醇法脫除紅芪多糖中的蛋白質。
3.2 紅芪多糖分離純化紅芪多糖經Sephadex G-25柱層析純化分離的洗脫曲線(見圖2)。僅出現 1個洗脫峯， 收集主峯， 透析， 濃縮，冷凍乾燥， 得到 HPS-2。
3.3 純度鑑定HPS-2的`紫外掃描在 26～28nm處吸收峯消失，茚三酮反應呈陰性，說明樣品中的蛋白質基本除盡，也無核酸存在;碘-碘化鉀反應呈陰性，表明樣品爲非澱粉多糖;經 HPLC凝膠色譜後爲單一對稱峯。表明其爲均一組分;苯酚-硫酸法測定 HPS-2的糖含量爲 98.6%。