脂類是一類低溶於水而高溶於非極性溶劑的生物有機分子，下面是小編蒐集整理的一篇探究靶標代謝組學技術應用的論文範文，歡迎閱讀參考。
前言
繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等各種“組學”之後，代謝組學已迅速發展成爲系統生物學的一個重要分支。代謝組學是考察生物體系(細胞、組織或生物體)受刺激或擾動後(如將某個特定的基因變異或環境變化後)其所有小分子代謝產物的變化或其隨時間的變化，用以研究生物體系代謝途徑的一種技術[1].區別於其他組學針對生物大分子水平的研究，代謝組學關注的核心是小分子代謝產物羣的變化，進而從小分子代謝物變化的整體水平來揭示生命過程的動態變化和調控規律。根據研究對象和目的的不同，代謝組學的研究模式主要分爲兩種[2-3]:非靶標代謝組學和靶標代謝組學。
非靶標代謝組學[2,4-5]研究較爲普遍，旨在儘可能全面地分析生物樣本中所有代謝物(包括未知化合物)，從總體上把握整體輪廓及其代謝變化規律，尋找潛在生物標誌物，具有全局分析的優勢。但同時也存在一定的不足，如易遺漏一些低濃度物質的變化，達不到全局分析的目的;進行半定量分析，準確度不高，結果可信度較低;只是一個相對模糊的全景模式，對於不同的疾病和代謝路徑缺乏特異性。非靶標代謝組學分析較多地採用核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)和氣相色譜串聯質譜(gaschromatography-massspectroscopy,GC-MS)技術平臺。
NMR能實現對樣品的非破壞性、非選擇性分析，滿足對儘可能多的化合物進行檢測的目標;GC-MS具有較高的分辨率和檢測靈敏度，並且有可供參考的標準譜圖數據庫，可以用於代謝物的準確定性分析。隨着新的分析方法的不斷髮展，目前對於非靶標代謝組學的分析，往往透過組合不同的分析技術，以實現代謝組的全面分析。
靶標代謝組學[2,4]是對特定的目標代謝物的精確定性定量分析，主要研究特定結構功能類型的代謝物羣，例如脂肪酸類、磷脂類、嘌呤嘧啶類或氨基酸類等。作爲一種特定模式，可以根據非靶標代謝組學的研究結果，對特定的代謝物羣進行定量分析，彌補非靶標代謝組學的不足。其主要優勢是可以利用建立的數據庫，結合多種代謝通路，對目標代謝物進行定量分析，準確度高，特異性強。但其缺點[6]是需依賴先驗知識，建立方法依賴於標準品，對於生物樣本代謝組資訊的覆蓋仍有侷限，不適用於大規模的代謝輪廓分析。靶標代謝組學分析主要採用基於質譜的分析技術，三重串聯四級杆質譜[7](triplequadrupole/massspectroscopy,QQQ/MS)因其在定量分析上的獨特優勢成爲靶標代謝組學分析的首選。氣相色譜三重串聯四級杆質譜(GC-QQQ/MS)和液相色譜三重串聯四級杆質譜(LC-QQQ/MS)聯用技術可以對不同極性的目標代謝物進行高選擇性﹑高靈敏度和高通量的定量分析，完成對大量生物樣本潛在生物標誌物的驗證。一般在GC-MS系統上用選擇離子監測(selectedionmonitoring,SIM)或者在LC-MS系統上用多反應離子監測(mul-tiplereactionmonitoring,MRM)進行靶向MS/MS分析[3],其中LC-MS因其樣品處理過程簡單、分析速度快等優勢，應用更爲廣泛。本文主要介紹靶標代謝組學技術在不同代謝物羣研究中的應用。
1脂類化合物
脂類是一類低溶於水而高溶於非極性溶劑的生物有機分子。對於大多數脂類而言，其化學本質是脂肪酸和醇所形成的酯類及其衍生物。由於脂類結構複雜，功能繁多，生物樣本本身又相當複雜，因此迄今沒有一種分析手段能獨立完成系統的大規模脂類分析。常用的脂類物質分析技術有軟電離質譜和液質聯用,如電噴霧電離(electrosprayionization)質譜(ESI/MS)技術在脂類的表徵、定性和定量分析中就發揮了重要的作用。隨着研究不斷深入，新的分析方法不斷建立，脂類代謝物數據庫不斷髮展完善。
脂肪酸是構成人體脂肪和類脂的基本物質，是細胞膜磷脂的重要成分[8].研究表明[9-14],脂肪酸代謝紊亂與某些疾病的發生有着密切的聯繫，檢測脂肪酸代謝的動態變化可用於研究機體從穩態發展爲疾病的過程，或者機體在接受治療後由疾病恢復到穩態的過程。此外，脂肪酸含量變化也可作爲某類疾病的生物標誌物，用於疾病的預警和診斷。脂肪酸是由一條長的烴鏈和一個末端羧基組成的羧酸，烴鏈的長度和不飽和度很大程度上影響了脂肪酸的性質。脂肪酸的分析常採用GC-MS技術，但是該法提取和衍生化過程繁瑣;而LC-MS分析方法因樣品處理過程簡單而得到越來越多的應用。
近年來，短鏈脂肪酸(shortchainfattyacids,SCFA)和支鏈氨基酸(branchedchainaminoacids,BCAA)因其在生理和病理過程中的重要作用，而受到研究者的廣泛關注。Zheng等[15]採用氯甲酸丙酯(propylchloroformate,PCF)衍生化的方法，用GC-MS同時測定餵食不同營養成分的家兔糞便樣品中SCFA和BCAA的含量。在pH8的水∶丙醇∶吡啶(V/V/V=8∶3∶2)反應液中加入100μlPCF進行衍生，然後用正己烷對衍生後的產物進行兩步提取。該法衍生化效率高、檢測限低、回收率高，已成功用於正常人糞便、血漿及尿樣中SCFA和BCAA的檢測。
類二十烷酸也稱類花生酸，由二十碳多不飽和脂肪酸衍生而來，大多數的類二十烷酸是花生四烯酸的衍生物，如前列腺素類(prostaglandin,PG)，凝血唑惡烷類(thromboxanes,TX)和白三烯類(leukotriene,LT)。類二十烷酸是炎症和氧化應激反應中的主要調節介質，也常作爲某些病理狀態或癌症的生物標誌物。不同類型的二十烷酸化學性質可能不同，加上其相對不穩定性，使得類二十烷酸的全面定量分析變得困難。尿液中類二十烷酸的分析通常採用GC-MS或LC-MS/MS,但一般需要複雜的樣品提取和衍生化過程。對於類二十烷酸的分析方法已有大量研究報道，但對於不同代謝通路產生的類二十烷酸的定量分析研究比較罕見。Sterz等[16]使用超高效液相色譜-串聯質譜(ultraperformanceliquidchromatography-SIM-MS/MS,UPLC-SRM-MS/MS)建立了一種簡單靈敏的方法用於定量分析尿液中的類二十烷酸。相比於耗時複雜的固相提取方法，該研究採用了一種較爲簡單的液液提取方法;此外，所有化合物進入質譜後，在選擇反應監測(selectedreactionmonitoring,SRM)模式下，經碰撞解離產生特徵離子對，不需要進行衍生化，即可進行檢測，操作簡便。採用該法實現了對尿液中多種主要類二十烷酸的定量分析，包括PG類(PGE-M、PGF2a)、TX類(TXB2)、LT類(LTE4)及12-羥基花生四烯酸等。該方法成功應用於吸菸者尿液中類二十烷酸的測定(吸菸和尼古丁的攝入會引起尿液中類二十烷酸水平的升高)，證明了該法的適用性。
二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid,DHA)在大腦中含量非常豐富，是一種對人體非常重要的ω-3多不飽和脂肪酸，對維持大腦的正常功能具有重要作用。研究表明，DHA含量變化和氧化作用的發生與神經退行性疾病相關;在某些病理狀態下，DHA的氫過氧化物(hydroperoxy-DHA,HpDoHE)和氫氧化物(hydroxide-DHA,HDoHE)的含量也會有所增加。可見對於DHA氫過氧化物和氫氧化物的鑑定和分析具有重要的臨牀意義。Derogis等[17]建立了一種靈敏度高、專屬性強的方法，用於定量分析12種主要HpDoHE和氫HDoHE的異構體。在該研究中，透過光致氧化合成HpDoHE,然後進一步使用硼氫化鈉(NaBH4)還原得到HDoHE.分離得到的異構體使用LC-MS/MS的SRM模式爲每一個異構體創建相應的特徵離子對，實現了對各個異構體的定量分析。採用該法測定大鼠血漿和腦中HpDoHE及HDoHE異構體的含量，已證明其適用性。此外，該法可用於HpDoHE和HpDoHE衍生物的鑑定和定量分析，對於氧化脂質組的研究也具有重要的意義。
磷脂是生物組織中非常重要的一類脂質，不僅是生物膜的主要成分，並且作爲重要的代謝物參與大量的生命活動(如細胞中信號轉導、膜固定及底物轉運等)。正是由於在生物體代謝過程中的重要作用，磷脂也成爲脂質組學研究的一個熱點。質譜被廣泛應用於磷脂的分析，但由於離子抑制效應等因素，低丰度的磷脂往往較難檢測出來。在進行質譜分析前，對不同種類的磷脂進行預分離，可提高檢測的靈敏度和重複性。Kim等[18]採用HPLC-MS從大鼠心臟和骨骼肌線粒體中分離檢測到7種磷脂類化合物(磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽鹼、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、心磷脂及單溶心磷脂)，並且對其中6種(磷脂酰絲氨酸除外)進行了定量分析。該法優化了提取純化步驟，提高了靈敏度和重複性，爲線粒體中磷脂類化合物的分析提供了一種較好的定性和定量分析方法。
鞘磷脂即鞘氨醇磷脂，在磷脂酶的作用下，可水解爲磷酰膽鹼和神經酰胺，這些代謝物在調節細胞生長、分化和程序性死亡的`機制中發揮着重要的作用。Blaas等[19]以C6-鞘磷脂爲內標，採用親水作用色譜-高效液相串聯質譜(HILIC-HPLC-ESI-MS/MS)對人體母乳中的鞘磷脂進行了定量分析;提取後的母乳樣品採用硅膠固相提取方法純化，分離得到的鞘磷脂經磷脂酶水解得到相應的神經酰胺，然後採用反相高相液相串聯質譜(RP-HPLC-ESI-MRM/MS/MS)對鞘磷脂進行了結構確證。該法爲母乳中不同結構類型的鞘脂的研究提供了新的思路。
2肉毒鹼
肉毒鹼是類維生素，是機體脂肪酸代謝必需的一種輔酶，可與長鏈脂肪酸結合形成酰基肉鹼，作爲載體，將脂肪酸運送至線粒體基質中，完成β-氧化;此外，在支鏈氨基酸的代謝中肉毒鹼也發揮着重要的作用。血漿中肉毒鹼和酰基肉毒鹼的檢測，對於診斷由脂肪酸代謝紊亂引起的疾病具有很大的幫助。
Peng等[20]採用串聯四級杆離子阱質譜(QTRAP-MRM-MS/MS)建立了一種快速準確的方法來分析肉毒鹼和酰基肉鹼。該法無需衍生化，避免了以往文獻中存在的衍生化反應不完全及酰基肉鹼水解等影響因素;採用HILIC預先分離肉毒鹼和酰基肉鹼，可以較好地分開各異構體，排除干擾物質的影響，避免假陽性結果。爲考察方法的適用性，對216名健康人和116名患者血漿中肉毒鹼和酰基肉鹼進行檢測，結果發現49名患者爲有機酸血癥或者脂肪酸代謝紊亂。
對乙酰氨基酚(paracetamol)是一種廣泛使用的止痛劑，過量服用會造成肝毒性或引起其他急性肝損傷。線粒體功能障礙和氧化應激損傷是對乙酰氨基酚導致肝損傷的重要作用機制。新研究發現，服用過量對乙酰氨基酚患者的血漿中谷氨酸脫氫酶活性增強，線粒體DNA的濃度增加，並將其作爲線粒體損傷的生物標誌物。但是這些標誌物相對分子質量較大，要在細胞死亡或細胞膜破損時才能從細胞中釋放出來。McGill等[21]採用超高效液相色譜-四級杆飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)，應用代謝組學的方法來篩選線粒體損傷的生物標誌物。呋塞米(呋喃苯胺酸，furosemide)是一種利尿劑，也可以引起肝損傷，但給藥初期不會造成線粒體損傷，對小鼠分別給予過量對乙酰氨基酚和呋塞米，發現給予對乙酰氨基酚的小鼠血漿中3種酰基肉鹼的含量增加，而給予呋塞米的小鼠血漿中未發現酰基肉鹼含量的顯着變化，表明酰基肉鹼的含量變化也許可以作爲小鼠線粒體功能障礙的特徵生物標誌物。採用該方法，檢測服用過量對乙酰氨基酚而致肝損傷的患者血漿中的酰基肉鹼含量，結果未發現酰基肉鹼的顯着變化。分析其可能的原因是患者在服用過量對乙酰氨基酚後，給予N-乙酰半胱氨酸進行解毒，影響了酰基肉鹼的測定。爲探究給藥後人血漿和小鼠血漿差異產生的原因，該研究小組對小鼠給予過量對乙酰氨基酚後給予N-乙酰半胱氨酸，對小鼠血漿進行檢測，發現給予N-乙酰半胱氨酸後酰基肉鹼的含量較給予對乙酰氨基酚後酰基肉鹼的含量有所下降。該方法中發現的小鼠線粒體損傷時可能的生物標誌物-酰基肉鹼，對於尋找與線粒體損傷相關的人類疾病(未經過N-乙酰半胱氨酸治療)生物標誌物提供了研究思路。
3核苷類化合物
核苷類化合物是維持生命活動所需的基本物質，是構成DNA和RNA的基本物質，因其具有廣泛的生理活性，可以用於抗腫瘤抗病毒[22]等的治療。某些疾病的發生也與核苷類物質的代謝異常相關，因此，核苷類化合物含量的變化可以作爲生物標誌物，用於某些疾病的診斷[23-29].目前，HPLC、毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、HPLC-MS以及GC-MS等分析方法已用於核苷類物質的分析。
謝玉萍等[30]採用HPLC-ESI/MS/MS技術，結合MRM模式，建立了同時檢測19種核苷的方法。該方法具有靈敏度高、選擇性強、定量準確及分析速度快等優點，可用於分析不同生長狀態的大腸桿菌中核苷的種類和含量隨時間的變化趨勢。
Struck等[27]建立了一種定量分析泌尿生殖系統癌症患者尿樣中核苷的方法，利用HPLC-ESI-QQQ/MS/MS技術，結合MRM模式，在17min內同時檢測12種核苷，觀察覈苷代謝變化，爲進一步研究核苷類物質作爲癌症生物標誌物的可能性提供了方法。
Stentoft等[31]建立了一種簡單且重複性好的前處理方法，採用LC-MRM/QQQ/MS/MS技術，同時準確定量分析了奶牛血漿中20種不同結構性質的嘌呤嘧啶代謝物，並且透過分析不同基質(血漿、尿液、牛奶)和不同物種(牛、雞、豬、大鼠、人)採集的血液中嘌呤嘧啶代謝物，考察了該方法的適用性。修飾核苷是機體的代謝產物，在轉錄後由多種特定的甲基轉移酶和連接酶作用於多聚核苷分子而形成，其作用與維繫自身結構和調節功能有關。Li等[32]收集了25名健康人和51名冠狀動脈疾病(coronaryarterydisease,CAD)患者的尿樣，預處理後，採用固相萃取法提取、純化甲基化的核苷，繼而採用HPLC-ESI-SRM/MS/MS技術共分析了6種甲基化的核苷(N3-甲基胞苷、N1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N2-甲基鳥苷、N1-甲基鳥苷和N2,N2-二甲基鳥苷)，其中N6-甲基腺苷在CAD患者與健康對照組尿液中的含量變化具有明顯的差異。表明尿液中N6-甲基腺苷的含量變化可能與冠狀動脈疾病相關。
Xia等[29]採用HPLC-UV/MS/MS對2型糖尿病患者中糖尿病性腎病患者肌酐和嘧啶循環相關代謝物進行定量分析。發現患者血漿中胞嘧啶、胞苷、胸苷含量顯着增高，而尿苷、胸腺嘧啶及脫氧尿苷含量沒有顯着變化。該研究結果表明，胞嘧啶、胞苷、胸苷含量變化可用於糖尿病病情發展的檢測及治療效果的評價。
4氨基酸類化合物
氨基酸(aminoacid,AA)是構成蛋白質的基本單位，賦予蛋白質特定的分子結構形態;作爲細胞的信號分子，可調節基因的表達和蛋白質的磷酸化級聯反應;AA還能轉化爲其他的物質(如丙酮酸鹽、2-氧化戊二酸和延胡索酸等)進一步進入三羧酸循環，參與能量代謝。此外，AA代謝作爲中心碳代謝的重要部分，發揮着關鍵作用。越來越多的研究表明AA的代謝變化可用於疾病的分析[33-36].因此，建立一種簡單、可靠的AA定量分析方法具有重要的意義。AA種類較多且結構相似，大部分沒有紫外和熒光響應，爲提高分離度和檢測靈敏度，一般將其衍生化後再進行定性定量分析。已發展的AA測定方法有很多，常見的有GC-MS[37]、LC-MS[38-41]及CE-MS[42-44]技術。Piraud等[45]利用LC-MRM/MS技術建立了一種新的無需衍生化來檢測AA的方法，爲遺傳性AA代謝紊亂的檢測提供了技術支援。Salazar等[40]利用6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯進行衍生化，採用穩定同位素標記和MRM模式，應用AccQ·Tag-UPLC-ESI-MS/MS技術對擬南芥葉提取物中的AA進行定量分析。該方法通量高，選擇性好，可以實現在10min內檢測38種代謝物，檢測限達1.02×10-11mol/L,較其他方法靈敏度提高1~5個數量級。
慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)是呼吸系統常見病之一。近年來，COPD的基礎研究和治療方法都不斷深化。Ubhi等[35]採用LC-MS/MS技術研究不同類型COPD患者血清樣品，檢測34種AA和二肽代謝變化，發現AA代謝變化可用於COPD的診斷及區分COPD的不同亞型。特別是γ-氨基丁酸的含量變化可用於監測療效及具有惡病質的胰腺癌復發情況。
非對稱二甲基精氨酸(asymmetricdimethylargi-nine,ADMA)是一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)競爭性抑制劑[46],透過抑制血管內皮細胞NOS抑制一氧化氮(nitricoxide,NO)合成，NO合成和分泌減少，會導致血管張力調節機制受損[47]等[48]建立了一種LC-ESI-SIM/MS方法定量分析了T2DM患者血漿中L-精氨酸、ADMA和對稱性二甲基精氨酸。研究發現與對照組相比，ADMA的含量在T2DM患者中顯着增高，表明ADMA的含量變化可能與心血管疾病相關。
5結語
靶標代謝組學可用於驗證發現代謝組學提出的假說，進行基於假說的探索性實驗，針對特定代謝物，研究代謝模型。採用MRM技術和同位素稀釋或質量標籤標記的方法對篩選出來的標誌物定量，進行臨牀確證。代謝物的準確定量將使代謝組學研究更全面更可靠，有助於更清晰地研究疾病機制，達到疾病預警、指導和評價治療的目的。
靶標代謝組學和非靶標代謝組學各具優勢同時存在不足。考慮到非靶標和靶標分析各自的特徵和優勢，中科院大連化學物理研究所研究小組提出了擬靶向的概念[50].擬靶向技術方案的核心思想是將非靶向分析的高通量、無偏向的代謝物資訊獲取和靶向方法的高特異性檢測和準確定量相結合，從而實現對待測樣本中已知及未知的多個代謝物離子靶標進行同時檢測。該法在保證檢測靈敏度及對代謝組資訊覆蓋的同時，顯着提高了數據的線性範圍以及重複性等指標，保證了後續的基於代謝組數據的標誌物發現及驗證。基於這一概念，其實驗室先後建立了基於GC-MS、LC-MS的擬靶向方法，並應用於植物代謝組學[49-50]、血清肝癌標誌物的篩選[51]及胃癌早期診斷標誌物的發現[52]等研究。
爲了使代謝組學研究更全面、結果更準確，應有效結合非靶標和靶標分析技術，兩種分析模式相結合，優勢互補。利用非靶標分析，從整體上把握代謝輪廓，鎖定關鍵代謝路徑，尋找潛在生物標誌物;利用靶標分析方法對關鍵代謝物進行準確定量，研究其在時間和空間上的變化規律。
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