摘要：以溴代硅膠爲引發劑，CuBr/2,2-聯吡啶爲催化體系，在改性硅膠上經二步表面引發原子轉移自由基聚合（SI-ATRP）製備內表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯（C18）、外表面接枝甲基丙烯酸環氧丙酯（GMA）、水解得到表面含大量二醇基的新型反相限進材料。使用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、元素分析和熱重分析（TGA）對其表徵，採用靜態吸附實驗研究反相限進材料的吸附性能，其對磺胺二甲氧嘧啶和土黴素的最大吸附量分別爲 18. 02 和 4. 80mg / g.結合固相萃取（SPE）評價其對大分子蛋白質的排阻性能，以牛血清白蛋白（BSA）作爲排阻大分子模型，排阻能力達 90%.將其用於牛奶中土黴素的分離富集，經高效液相色譜（HPLC）檢測，土黴素的平均加標回收率爲89. 19% ,相對標準偏差爲 3. 03% .有望將新型反相限進材料和 HPLC 或液相色譜-質譜（LC-MS）等分析系統結合應用於生物樣品的處理和檢測。
關鍵詞：限進材料；表面引發原子轉移自由基聚合；牛血清白蛋白；磺胺二甲氧嘧啶；土黴素；牛奶。
Abstract:A novel reversed phase restrict access material was prepared via two steps of sur-face-initiated atom transfer radical polymerization （SI-ATRP）。 The stearyl methacrylate （C18）and glycidylmethacrylate （GMA）were grafted on inner and outer surfaces of modified silica,allowing brominated silica and CuBr / 2,2-pyridine to serve as macro-initiator and catalyst sys-tem. After hydrolysis,we got a hydrophilic reversed phase restrict access material with rich gly-col group, which was characterized by Fourier transform infrared （FT-IR ） spectrum,elementary analysis and thermogravimetric （TGA）analysis. The static adsorption experimentwas employed for evaluating the binding capacity of the novel reversed phase restrict accessmaterial. The maximum adsorption amounts of sulfadimethoxine and oxytetracycline were18. 02 and 4. 80 mg / g,respectively. The properties of material for the exclusion of proteins likebovine serum albumin （BSA）were evaluated using solid-phase extraction （SPE）and its exclu-sion value up to 90%. The novel reversed phase restrict access material was used for the separa-tion and enrichment of oxytetracycline in milk. The high-performance liquid chromatography（HPLC）was used to detect the oxytetracycline and the average recovery was 89. 19% with therelative standard deviation （RSD）of 3. 03%. It is expected that the novel inversed restrictaccess material combined with HPLC or liquid chromatography-mass （LC-MS）analysis systemis applied to the extraction and detection of biological samples.
Key words:restrict access material;surface-initiated atom transfer radical polymerization.
表面引發原子轉移自由基聚合（surface-initiated atom transfer radical polymerization,SI-ATRP）是一種強大且靈活的合成技術，其適用的單體範圍廣，反應條件溫和，分子設計能力強，可合成預定結構和序列的聚合物[1-3] 等[4]透過反 ATRP 技術製備手性整體固定相，以 β-環糊精（β-CD）作爲手性選擇劑，採用 ATRP 技術在表面接枝親水聚合物刷來提升柱的生物相容性，將此材料結合 HPLC 檢測血漿中的手性藥物。Lv 等[5]透過逐層修飾成功製備了限進介質分子印跡磁性微球，用於磁性微萃取牛奶中的雙酚 A,此限進介質分子印跡磁性微球選擇性高，避免了生物樣品中蛋白質在微球表面的沉積。
限進材料是 20 世紀 80 年代[6,7]發展起來的一種用於生物樣品直接進樣的固相萃取材料。最初，Boos 等[8-10]提出烷基-二醇基限進材料（alkyl-diol-silica,ADS），並結合 HPLC 檢測血漿、尿液等樣品中的藥物分子。喻昕等[11]提出了一種製備 ADS 固定相的改進方法。限進材料提供了以下優勢[12-14]:第一，材料的親水性外表面可以防止樣品基質中的蛋白在表面發生不可逆吸附，延長使用壽命，減少成本；第二，材料內表面的配體可以變換不同的基團種類，如 C4、C8、C18或離子交換官能團等；第三，將新型材料與簡便、多樣及相容性較高的 HPLC 或 LC-MS 等分析系統相結合[15-17],爲生物樣品中藥物殘留檢測提供了一條非常有前景的發展途徑。Wang等[18]把 β-環糊精固定在硅膠內部，構建手性結合層，再透過 SI-ATRP 反應把甲基丙烯酸縮水甘油酯接枝到表面，用該手性限進材料檢測並拆分生物樣品中的扁桃酸和氯噻酮。Wang 等[19]在硅膠表面引入十八烷基鏈和苄基氯，透過 SI-ATRP 接枝甲基丙烯酸環氧丙酯，水解得到表面含二醇基的反相限進材料，用於牛奶中鄰苯二甲酸酯類物質的分離富集，但接枝十八烷基鏈沒有采用 SI-ATRP 技術，以致單體接枝不夠均勻，接枝密度不夠高。
甲基丙烯酸十八烷基酯[20]是具有 18 個碳的直鏈烷烴，但將其應用於限進材料的製備未見報道。近年來已有將 ATRP 技術用於製備限進材料的文獻，但功能單體接枝量和接枝密度都有待提升。本文透過二步 SI-ATRP 技術在硅膠表面接枝兩種不同的功能單體，接枝量高，接枝密度大。新型反相限進材料外表面的親水層有效避免樣品基質的干擾，對小分子具有萃取能力，但選擇性不夠高，有待繼續研究。最後以新型反相限進材料爲萃取基質，結合HPLC 檢測牛奶樣品中的土黴素（OTC）。
1 實驗部分。
1.1 儀器、試劑與材料。
LC-20AT 高效液相色譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司），TU-1810 紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），Vario ELII元素分析儀（德國 Elementar 公司）。
100 ~ 200 目硅膠（青島海洋化工有限公司）；甲基丙烯酸十八烷基酯（純度 96%,含質量分數爲0. 01% 的氫醌-甲基醚穩定劑）、甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA,純度 97%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（純度 98%）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM,純度 99%）、OTC（純度 99%）、CuBr（化學純）、2,2-聯吡啶（純度99% ）、2-溴異丁酰溴 （純度 97% ）、牛血清白蛋白（BSA,純度 98%）（上海晶純試劑有限公司）；濃鹽酸、濃硫酸、異丙醇、甲醇、三乙胺、乙二胺四乙酸二鈉、四氫呋喃、甲苯均爲分析純（天津市大茂化學試劑廠）；牛奶（購於當地超市，寧夏夏進乳業集團股份有限公司）。其他試劑均爲國產分析純。
1.2 新型反相限進材料的製備過程。
1.2.1 氨丙基硅膠（Silica-NH2）的製備。
稱取 10. 0 g 硅膠置於 250 mL 圓底燒瓶中，加入 100 mL 20% （體積分數）鹽酸，超聲分散均勻，於110 ℃ 油浴中迴流 8 h.水洗至中性，用乙醇和丙酮各洗 3 次，於 120 ℃真空乾燥。取 3. 0 g 活化硅膠置於圓底燒瓶中，加 50 mL 無水甲苯，超聲分散均勻。在 N2保護下緩慢滴加 5. 20 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，於110 ℃反應24 h.用甲苯、丙酮各洗3 次，於 60 ℃ 真空乾燥，即得到 Silica-NH2.
1.2.2 2-溴異丁酰溴氨丙基硅膠（Silica-Br）的製備。
冰浴條件下，將 3. 0 g 氨丙基硅膠分散於 30mL 無水四氫呋喃中，攪拌 1 h,加入 2. 3 mL 三乙胺，再逐滴加入 1. 5 mL 2-溴異丁酰溴，混合物在0 ℃ 下攪拌 30 min,室溫反應 24 h.用四氫呋喃、甲醇和水依次洗滌，於 60 ℃真空乾燥，即得到 Silica-Br.
1.2.3 釆用 SI-ATRP 在硅膠內表面接枝甲基丙烯酸十八烷基酯。
圓底燒瓶中加入 3. 0 g 溴代硅膠作爲引發劑，加入 143 mg CuBr 和 312 mg 2,2-聯吡啶。另一圓底燒瓶中加 20 mL 無水甲苯和 20 mL 甲基丙烯酸十八烷基酯，採用真空惰性氣體操作管線裝置，充氮除氧 30 min,在 N2保護下於 60 ℃反應 24 h,分別用異丙醇、二次蒸餾水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二鈉水溶液、水和乙醇洗滌，於 60 ℃真空乾燥，即得到Silica-Br-C18.
1.2.4 釆用 SI-ATRP 在硅膠外表面接枝 GMA 鏈。
圓底燒瓶中加入 3. 0 g 接枝 C18的溴代引發劑硅膠、0. 40 g CuBr 和 1. 28 g 2,2-聯吡啶。另一圓底燒瓶加入 100 mL 異丙醇和 10 mL GMA,超聲分散均勻。採用真空惰性氣體操作管線裝置，充氮除氧 30 min.在 N2保護下於 40 ℃反應 24 h,通入空氣終止反應，依次用異丙醇、甲醇、水、0. 2 mol/ L 乙二胺四乙酸二鈉水溶液、水和丙酮洗滌，於 60 ℃真空乾燥，即得到 Silica-Br-C18-GMA.
1.2.5 GMA 鏈水解。
所得產物（Silica-Br-C18-GMA）置於 100 mL 圓底燒瓶中，加入 60 mL 0. 1 mol/ L 硫酸，60 ℃水解12 h,反應完畢後，水洗至中性，於 40 ℃ 真空乾燥，即得到新型反相限進材料（Silica-Br-C18-GMMA）。
1.3 Silica-Br-C18-GMMA 限進行爲的評價。
爲體現新型反相限進材料的限進特點，選擇BSA 作爲排阻蛋白質大分子模型來評價其外表面的親水性特點。BSA 是相對分子質量約爲 68 kDa的疏水性蛋白質，經常用於模擬生物環境實驗。選擇結構不同的 SDM 和 OTC 作爲小分子模型（見圖1）來評價其內表面十八烷基鏈的萃取能力，透過靜態吸附實驗研究該新型反相限進材料對小分子的萃取能力。
1.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 對 BSA 的排阻。
在 6 mL 固相萃取（SPE）小柱內分別填充 200mg Silica-Br-C18-GMMA 和 200 mg Silica-Br-C18,使柱牀體積爲 2 mL,柱上下兩端用多孔性的聚四氟乙烯篩板，使小柱裝填均勻且空隙較少。裝填完成後，用 1 mL 甲醇和 3 mL 水平衡小柱，注入 3 mL 1g / L BSA 溶液，收集流出液，用紫外分光光度計在280 nm 處檢測不保留的 BSA 的吸光度。再用 2mL 水淋洗，用 2 mL 甲醇洗淨小柱。
1. 3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 對 SDM 和 OTC 的吸附。
取 20 mg Silica-Br-C18-GMMA 於 50 mL 具塞錐形瓶中，以甲醇爲溶劑分別配製一系列不同質量濃度的 SDM 和 OTC 溶液，25 ℃下振盪吸附 12 h,離心，取上清液過 0. 45 μm 濾膜，用紫外分光光度計在270 nm 處檢測溶液中的 SDM,在365 nm 處檢測溶液中的 OTC,重複實驗 3 次。根據吸附前後溶液中質量濃度的變化，計算出該新型反相限進材料對 SDM 和 OTC 的'平衡吸附量。平衡吸附量按公式（1）計算：
（1）。
其中，Q 爲吸附量（mg/ g），Co和 Ce分別爲初始濃度和平衡濃度（g/ L），V 爲溶液體積（mL），m 爲反相限進材料的質量（g）。
1.4 實際樣品測定方法。
1.4.1 樣品處理。
取 10. 0 mL 牛奶樣品置於 50 mL 離心管中，加入一定量 OTC,加 20 mL 乙腈，振盪混合均勻，超聲20 min,以 4 000 r / min 的速度離心 10 min,上清液過 0. 22 μm 濾膜，備用。
準確配製一系列質量濃度爲 4 ~ 10 mg/ L 的OTC 標準溶液。牛奶樣品中 OTC 加標量分別爲 3、5 和 9 mg / L,以新型反相限進材料作爲萃取基質對樣品進行分離純化，用 HPLC 檢測牛奶中 OTC 的含量。
1.4.2 色譜條件。
色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4. 6 mm,5μm）；流動相：質量分數爲 0. 1% 的乙酸銨水溶液-乙腈（87 ∶ 13,v/ v）；檢 測 波 長：353 nm;流 速：1mL / min;進樣量：20 μL.
2 結果與討論。
2.1 新型反相限進材料的製備。
新型反相限進材料採用二步 SI-ATRP 技術在硅膠內外表面分別接枝甲基丙烯酸十八烷基酯和GMA 鏈，合成路線見圖 2.以硅膠爲基質，表面引入氨基後，與 2-溴異丁酰溴反應得到溴代引發劑硅膠。選擇 CuBr/2,2-聯吡啶爲催化體系，甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 分別爲功能單體，分別在無水甲苯和異丙醇中進行二步自由基引發聚合，水解得到表面含二醇基的一種新型反相限進材料。得益於 SI-ATRP 技術，新型反相限進材料的疏水層和親水層接枝均勻，兩種功能單體接枝密度高，提高了對小分子的萃取能力和排阻蛋白質的能力。
2.2 新型反相限進材料的表徵。
2.2.1 紅外光譜分析。
紅外光譜常用來鑑定樣品表面所含有的功能基團。圖 3 是 Silica-Br、Silica-Br-C18、Silica-Br-C18-GMA 和 Silica-Br-C18-GMMA 的紅外光譜圖。808cm-1爲 -C-Br 的伸縮振動峯，證實溴代引發劑硅膠已製備成功。1 102 cm-1爲 -C-O 的伸縮振動峯，1 736 cm-1爲 -C=O 的伸縮振動峯，2 856 cm-1爲-CH2的不對稱伸縮振動峯，2 929 cm-1爲 -OH 的伸縮振動峯。對比圖 3 中曲線 b、c 和 a 可看出，-C-O 的伸縮振動峯、-C=O 的伸縮振動峯和 -CH2的不對稱伸縮振動峯增強，說明透過二步 SI-ATRP反應，活性自由基 Br·成功引發單體聚合，使甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 這兩種單體成功接枝到硅膠表面。對比圖 3 中曲線 c 和 d,-OH 的伸縮振動峯也明顯增強，說明環氧基開環成功。
2.2.2 元素分析。
對 Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA進行元素分析，分析數據見表 1.經二步 SI-ATRP反應後，Silica-Br-C18-GMMA 與 Silica-Br 相比，C 元素含量由 10. 1% 增至 33. 71%,H 元素含量由 1. 88% 增至 4. 95%,充分說明甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 成功接枝到硅膠表面。
2.2.3 熱重分析。
熱重分析是測定表面修飾聚合物接枝量的重要手段[21],圖 4 是 Silica-Br、Silica-Br-C18和 Silica-Br-C18-GMMA 的熱重分析圖。Silica-Br 在 29 ~ 270 ℃時失重百分比爲 8. 03%,主要由 3-氨基丙基三乙氧基硅烷和 2-溴異丁酰溴的熱分解造成。Silica-Br-C18在 26~260 ℃和 220~800 ℃時失重百分比分別爲 4. 82% 和 28. 20%,與 Silica-Br 相比，失重相對較大，這是由交聯劑和接枝到硅膠內表面的甲基丙烯酸十八烷基酯的損失造成。Silica-Br-C18-GMMA 在160 ~ 787 ℃ 時失重最大，失重百分比爲 55. 49% ,這主要是甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 鏈的損失所致。由此可證實兩種單體成功接枝在硅膠表面。
2.3 新型反相限進材料分離的富集性能。
2.3.1 Silica-Br-C18-GMMA 對 BSA 的排阻性能。
相同條件下，Silica-Br-C18和 Silica-C18-GMMA的蛋白質排阻回收實驗數據見表 ca-Br-C18透過 SI-ATRP 反應在硅膠表面只接枝 C18烷基鏈，疏水性較強，與 BSA 透過靜電作用結合，其結合BSA 的量爲 22. 9%ca-C18-GMMA 與 BSA 的結合量爲 12. 4%,低於 Silica-Br-C18,這是因爲該材料外表面的二醇基具有親水性，對 BSA 具有屏蔽作用，使其不能進入內表面，說明新型反相限進材料對BSA 具有排阻能力。
2.3. 2 Silica-Br-C18-GMMA 材料對 SDM 和 OTC的吸附能力。
以 SDM 和 OTC 作爲小分子模型，研究 Silica-Br-C18-GMMA 對小分子的吸附性能，結果見圖 5.隨着 SDM 初始濃度的增大，吸附量逐漸增大，當濃度大於 0. 9 mmol/ L 後趨於吸附平衡，最大吸附量爲 18. 08 mg/ g.隨着 OTC 初始濃度的增大，吸附量逐漸增大，當濃度大於 0. 15 mmol/ L 後，吸附量基本保持不變，最大吸附量爲 4. 4 mg/ ca-Br-C18-GMMA 材料內表面鍵合非極性的十八烷基鏈，與 SDM 和 OTC 的相互作用主要是疏水作用。從二者結構看，OTC 中含有 6 個羥基，極性大於 SDM,所以 OTC 的疏水作用小於 SDM,故 SDM 的吸附量大於 OTC 的吸附量；從空間位阻看，可能由於限進材料外表面具有大量羥基，分子量小的 SDM 更容易進入內表面與十八烷基鏈產生相互作用。SDM 和OTC 在新型反相限進材料上都有一定量的吸附，證明新型反相限進材料除了外表面具有親水的二醇基之外，其內表面的 C18鏈具有萃取小分子物質的能力，體現出新型反相限進材料的雙官能團特點。
2.4 實際樣品的測定。
用 HPLC 檢測處理過的牛奶樣品，結果未檢測到 OTC.以新型反相限進材料爲萃取基質，進行OTC 加標回收試驗。
使用新型反相限進材料結合 HPLC 分離富集並檢測牛奶樣品中的 OTC.圖 6a 爲 9 mg/ L OTC 標準溶液的色譜圖，出峯時間爲 9 min;圖 6b 爲牛奶加標 OTC（9 mg/ L）樣品經新型反相限進材料處理的液相色譜圖；圖 6c 爲牛奶空白樣品。以 OTC 的峯面積 y 對質量濃度 x（mg/ L）做標準曲線，線性方程爲 y=15. 907x-41 617,相關係數爲 0. 992 7,表明OTC 在對應的 4 ~ 10 mg / L 範圍內具有良好的線性關係。OTC 的平均加標回收率爲 89. 19%（n = 3），其 RSD 爲 3. 03%.
3 結論。
本文采用二步 SI-ATRP 技術將甲基丙烯酸十八烷基酯和 GMA 鍵合到硅膠表面，製得新型反相限進材料。傅里葉變換紅外光譜分析、元素分析和熱重分析數據均表明兩種功能單體接枝成功。考察新型反相限進材料結合固相萃取小柱對蛋白質大分子的排阻性能，透過對比發現其對蛋白質的排阻效果良好；透過吸附實驗發現其對結構不同的小分子物質具有一定的吸附能力，說明內表面的十八烷基鏈具有萃取能力。該材料作爲吸附劑，用於分離富集牛奶樣品中的 OTC,效果良好。該新型反相限進材料有望應用於含有白蛋白、免疫球蛋白或血纖維蛋白原等大量蛋白質的複雜生物樣品的前處理和藥物小分子的檢測。
參考文獻：
[1] Mu S Y,Guo J,Yu C F,et al. Progress in Chemistry,2015,27（5）：539.牟思陽，郭靜，於春芳，等。 化學進展，2015,27（5）：539.
[2] Fumes B H,Silva M R,Andrade F N,et al. TrAC-TrendsAnal Chem,2015,71:9.
[3] Xu D,Dong X C,Zhang H Y,et al. J Sep Sci,2012,35:1573.
[4] Wang H S,Feng X Y,Wei J P. J Chromatogr A,2015,1409:132.
[5] Lv Y K,He Y D,Xiong X,et al. New J Chem,2015,39:1792.
[6] Hogendoorn E A,Van Zoonen P,Polettini A,et al. AnalChem,1998,70:1362.
[7] Haginaka J. TrAC-Trends Anal Chem,1991,10（1）：17.
[8] Vielhauer S,Rudolphi A,Boos K S,et al. J Chromatogr B,1995,666:315.
[9] van der Hoeven R A M,Hofte A J P,Frenay M,et al. JChromatogr A,1997,762:193.
[10] Boos K S,Rudolphi A,Vielhauer S,et al. Fresenius J AnalChem,1995,352:684.
[11] Yu X,Zhao R,Liu G Q. Chinese Journal of Chromatogra-phy,2001,19（2）：152.喻昕，趙睿，劉國詮。 色譜，2001,19（2）：152.
[12] Yang S H,Fan H,Classon R J,et al. J Sep Sci,2013,36:2922.
[13] Lv Y K,Guo Z Y,Wang J Z,et al. Anal Methods,2015,7:1563.
[14] Lv Y K,Zhao C X,He Y D,et al. IJSID,2012,2（6）：617.
[15] Wu X Y,Wang R,Xie H,et al. Chinese Journal of Chroma-tography,2012,30（8）：810.武曉玉，王榮，謝華，等。 色譜，2012,30（8）：810.
[16] Zhang X H,Wang R,Xie H,et al. Chinese Journal of Chro-matography,2013,31（5）：451.張曉慧，王榮，謝華，等。 色譜，2013,31（5）：451.
[17] Gasparrini F,Ciogli A,D'Acquarica I,et al. J ChromatogrA,2007,1176:79.
[18] Wang H S,Jiang P,Zhang M,et al. J Chromatogr A,2011,1218:1310.
[19] Wang C Z,Li M,Xu H H,et al. J Chromatogr A,2014,1343:195.
[20] Song Z Z,Zhang G C,Peng J W,et al. Journal of QufuNormal University （Natural Science），2001,21（1）：49宋昭崢，張貴才，彭俊文，等。 曲阜師範大學學報：自然科學版，2001,21（1）：49.
[21] Lumley B,Khong T M,Perrett D. Chromatographia,2004,60（1 / 2）：59.