摘 要： 隨着科學的不斷髮展，運用質譜法進行蛋白質的分析日益增多，本文簡要綜述了肽和蛋白質等生物大分子質譜分析的特點、方法及蛋白質質譜分析的原理、方式和應用，並對其發展前景作出展望。
關鍵詞： 蛋白質，質譜分析，應用
前言：
蛋白質是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在於所有生物細胞，約佔細胞幹質量的50%以上， 作爲生命的物質基礎之一，蛋白質在催化生命體內各種反應進行、調節代謝、抵禦外來物質入侵及控制遺傳資訊等方面都起着至關重要的作用，因此蛋白質也是生命科學中極爲重要的研究對象。關於蛋白質的分析研究，一直是化學家及生物學家極爲關注的問題，其研究的內容主要包括分子量測定，氨基酸鑑定，蛋白質序列分析及立體化學分析等。隨着生命科學的發展，儀器分析手段的更新，尤其是質譜分析技術的不斷成熟，使這一領域的研究發展迅速。
自約翰.芬恩()和田中耕一(ka)發明了對生物大分子進行確認和結構分析的方法及發明了對生物大分子的質譜分析法以來，隨着生命科學及生物技術的迅速發展，生物質譜目前已成爲有機質譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領域之一[1]。它的發展強有力地推動了人類基因組計劃及其後基因組計劃的提前完成和有力實施。質譜法已成爲研究生物大分子特別是蛋白質研究的主要支撐技術之一，在對蛋白質結構分析的研究中佔據了重要地位[2]。
1．質譜分析的特點
質譜分析用於蛋白質等生物活性分子的研究具有如下優點：很高的靈敏度能爲亞微克級試樣提供資訊，能最有效地與色譜聯用，適用於複雜體系中痕量物質的鑑定或結構測定，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。
2．質譜分析的方法
近年來涌現出較成功地用於生物大分子質譜分析的軟電離技術主要有下列幾種：1)電噴霧電離質譜；2)基質輔助激光解吸電離質譜；3)快原子轟擊質譜；4)離子噴霧電離質譜；5)大氣壓電離質譜。在這些軟電離技術中，以前面三種近年來研究得最多，應用得也最廣泛[3]。
3．蛋白質的質譜分析
蛋自質是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，複雜結構主要包括以肽鏈爲基礎的肽鏈線型序列[稱爲一級結構]及由肽鏈捲曲摺疊而形成三維[稱爲二級，三級或四級]結構。目前質譜主要測定蛋自質一級結構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數目和位置。
3.1蛋白質的質譜分析原理
以往質譜(ＭＳ)僅用於小分子揮發物質的分析，由於新的離子化技術的出現，如介質輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質譜技術開始用於生物大分子的分析。其原理是：透過電離源將蛋白質分子轉化爲氣相離子，然後利用質譜分析儀的電場、磁場將具有特定質量與電荷比值(Ｍ/Ｚ值)的蛋白質離子分離開來，經過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的Ｍ/Ｚ值，分析鑑定未知蛋白質。
3.2蛋白質和肽的序列分析
現代研究結果發現越來越多的小肽同蛋白質一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質序列測定方法支援這些研究的進行。現有的肽和蛋白質測序方法包括Ｎ末端序列測定的化學方法Edman法、Ｃ末端酶解方法、Ｃ末端化學降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作爲肽和蛋白質序列測定標準方法的Ｎ末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對於修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對Ｎ末端保護的肽鏈則無法測序[4]。Ｃ末端化學降解測序法則由於無法找到PITC這樣理想的化學探針，其發展仍面臨着很大的困難。在這種背景下，質譜由於很高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學家的廣泛注意。在質譜測序中，靈敏度及準確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作爲分析對象進行的。近年來隨着電噴霧電離質譜(electrospray ionisation，ESI)及基質輔助激光解吸質譜(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等質譜軟電離技術的發展與完善，極性肽分子的分析成爲可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量範圍則高達100000Da，目前基質輔助的激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI TOF MS)已成爲測定生物大分子尤其是蛋白質、多肽分子量和一級結構的有效工具，也是當今生命科學領域中重大課題——蛋白質組研究所必不可缺的關鍵技術之一 [5] 。目前在歐洲分子生物實驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白質一級結構(序列)譜庫，能爲解析FAST譜圖提供極大的幫助，併爲確證分析結果提供可靠的依據[6]。
3.3蛋白質的質譜分析方式
質譜用於肽和蛋白質的序列測定主要可以分爲三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白切成小的片段，然後用質譜檢測各產物肽分子量，將所得到的肽譜數據輸入數據庫，搜尋與之相對應的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質繪製“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產生的亞穩離子，透過分析相鄰同組類型峯的質量差，識別相應的氨基酸殘基，其中亞穩離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學探針或酶解使蛋白或肽從Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名爲梯狀測序(laddersequencing)，經質譜檢測，由相鄰峯的質量差知道相應氨基酸殘基。
3.3.1蛋白消化
蛋白的基團越大，質譜檢測的準確率越低。因此，在質譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質譜檢測的準確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質譜儀的檢測。現今最常用的酶爲胰蛋白酶(trypsin)，它於蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經胰蛋白酶消化後，會產生相同的多肽。
3.3.2基質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜測量法(MALDI-TOF MS) [7]