作者：竇麗華，馬玉奎，丁元升
【摘要】 目的 研究銀杏黃酮對D-半乳糖所致小鼠學習記憶能力下降和各項衰老指標的對抗作用，以期探討銀杏黃酮的抗衰老作用機制。方法 以D-半乳糖衰老模型小鼠爲實驗對象，以其體重、免疫器官重量、肝腦丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)的含量，全血谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-PＸ）、紅細胞過氧化氫酶(CAT)和腦中超氧化物歧化酶(SOD)的活力，腦中谷氨酸水平爲指標，全面考察銀杏黃酮的抗衰老作用。結果 銀杏黃酮(125、250、500mg/kg，ig)，能對抗連續6周給5%D-半乳糖0.25ml/10g所致小鼠腦組織中LPO、LF含量的升高，提高全血GSH-PＸ、紅細胞CAT和腦中SOD的活力，並對抗小鼠體重、脾臟及胸腺指數下降。結論 銀杏黃酮能有效地對抗D-半乳糖所致的小鼠多項衰老指標的出現，促進衰老小鼠的學習記憶能力。
【關鍵詞】 銀杏黃酮；D-半乳糖；衰老；小鼠；L-穀氨酸
【Abstract】 Objective By using the D-galactose-induced aging mice，the effects and mechanism of Ginkgo flavone on aging were investigated.Methods Ginkgo flavone were given to mice by ig and D-galactose were injected into mice for six ，the ability of study of mice，the content of LPO，LF and the L-glutamate，the body weight，the index of thymus and spleen，the activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)and whole blood glutathione peroxidase(GSH-PＸ)were determined.Results To the D-galactose-induced aging mice，Ginkgo flavone(125，250，500mg·kg－１，ig)reduced the content of LPO，LF，L-glutamate in brain，inhibited the decrease of body weight and the weight of thymus and spleen，enhance the activities of SOD in brain，CAT in erythrocyte and whole blood GSH-PＸ.Conclusion Ginkgo flavone shows a remarkable anti-aging effect on the D-galactose-induced aging mice.
【Key words】 Ginkgo flavone； aging； D-galactose； mice； L-glutamate
銀杏黃酮(Ginkgo flavone)是從中草銀杏中提取分離的有效成分，及基礎研究［１，２］表明，銀杏黃酮對衰老和老年性癡呆有一定的治療作用，認爲作用機制可能是使衰老動物和老年性癡呆人腦組織中M１受體上調。但衰老是個綜合過程，涉及機體各個系統、不同結構層次的多項指標。目前銀杏黃酮對老化相關酶、老化代謝產物的影響報道尚少，特別是穀氨酸和衰老的關係是近幾年研究的熱點［３］。本文采用D-半乳糖衰老模型小鼠考察了Ginkgo flavone 對上述多項指標的影響，同時測定動物學習記憶能力的變化。
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1.1 動物 昆明種小鼠［合格證號：SCXK(魯)20030004］♂，體重18～22g，由山東大學實驗動物中心提供。
1.2 藥品與試劑 銀杏黃酮(Ginkgo flavone)：瀋陽藥科大學植化教研室提供。D-半乳糖：Sigma公司生產，上海生化試劑公司分裝，批號：980927。硫代巴比妥酸(Thibarbituric acid，TBA)：上海製劑二廠，批號：920620。苄胺(Benzyl amine)：新華活性材料研究所，批號：20000123。谷胱苷肽(GSH)：上海政翔醫用科技實業服務部化學試劑研究所，批號：990915。二硫硝基苯(dithionitobenzene；DTNB)：FLUKA產品，批號：980716。L-穀氨酸：上海康達氨基酸廠產品，批號：20000531。茚三酮：上海試劑三廠產品，批號：990325。GSH-PＸ、CAT、SOD測定試劑盒均爲南京建成生物工程研究所提供，批號：20030225。
1.3 儀器 WFZ800-D2型紫外可見分光光度計，北京第二光學儀器廠；HITACHI650-60型熒光分光光度計，日本；電泳儀，DYY-Ⅲ型，北京六一儀器廠；721分光光度計，上海第三分析儀器廠；910雙波長薄層掃描儀，日本島津公司。
2 方法
2.1 D-半乳糖衰老模型的建立［４］ 取健康♂小鼠75只，隨機分爲正常組、模型組、給藥組。各給藥組ig Ginkgo flavone(125、250、500mg/kg)；正常組和模型組ig等體積的CMCNa；給藥同時模型組和各給藥組皮下注射5%D-半乳糖0.25ml/10g；正常組皮下注射等體積的生理鹽水；連續6周，最後1天灌胃和注射D-半乳糖2h後，進行學習記憶訓練實驗，次日測定記憶成績。然後處死，測定各項衰老指標。
2.2 D-半乳糖衰老模型小鼠學習記憶能力的測定(跳臺法)［５］ 將動物放入跳臺箱內適應3min，然後立即通36V交流電。動物受到電擊，其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，如此訓練5min。24h後重做測驗，此即記憶保持測驗。記錄小鼠第1次跳下平臺的潛伏期和5min內的錯誤次數。
2.3 D-半乳糖衰老模型小鼠腦組織MDA、LF含量測定［４］小鼠斷頭處死，立即取腦，用硫代巴比妥酸(TBA)法測定組織丙二醛(MDA)的含量；用熒光法測定腦組織中LF的含量。
2.4 D-半乳糖衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細胞CAT和腦中SOD活力的測定 小鼠末次給藥後第2天眼眶取血，斷頭處死取全腦，分別按試劑盒說明測定GSH-PＸ、CAT和SOD。
2.5 小鼠腦組織中谷氨酸含量的測定［６］ 小鼠斷頭處死，立即取全腦適量，用0.61mol/L的三氯乙酸製作10%的勻漿，取上清液用石油醚-正丁醇洗後，點樣，電泳，茚三酮顯色後用雙波長薄層掃描儀測定全腦穀氨酸的含量。
2.6 學方法 各組數據採用x±s表示，組間比較採用t。
3 結果
3.1 銀杏黃酮對衰老模型小鼠體重及免疫器官重量的'影響 與正常組比較，衰老模型小鼠體重及胸腺和脾臟指數降低，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制體重、胸腺和脾臟指數的降低，見表1。
Tab 1 The effect of Ginkgo flavone on the index of body weight，thymus and spleen of D-galactose-induced seniled mice （x±s，n=15）
注：＃＃P＜0.01，compared with control group；**P＜0.01，*P＜0.05，compared with model group
3.2 銀杏黃酮對衰老模型小鼠學習記憶的影響 與正常對照組相比，模型組小鼠記憶明顯衰退，表現爲錯誤次數增加，潛伏期縮短(均P＜0.01)。與模型組比較，銀杏黃酮(125，250，500mg/kg)可使小鼠錯誤次數明顯減少，潛伏期明顯延長，見表2。
Tab 2 The effect of Ginkgo flavone on the eeficit of learning and memory induced by D-galactose on mice in step-down tese (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，compared with normal group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with model group
3.3 銀杏黃酮對D-半乳糖致小鼠衰老模型腦內LPO、LF、含量的影響 與正常組比較，衰老模型小鼠腦組織中LPO、LF、含量增高，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制LPO、LF含量的增高，見表3。
Tab 3 Effect of Ginkgo flavone on the content of LPO and LF on D-galactose-induced seniled mice (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01 compared with control group；*P＜0.05，**P＜0.01，compared with D-galactose group
3.4 銀杏黃酮對D-半乳糖致衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細胞CAT和腦中SOD活力的影響 與正常組比較，衰老模型小鼠全血GSH-PＸ、紅細胞CAT和腦中SOD活力明顯降低，而銀杏黃酮(125、250、500mg/kg)可顯著抑制3種酶活力的降低，見表4。
Tab 4 Effect of Ginkgo flavone on the activity of SOD of brain，CAT of erythrocyte and GSH-PX of blood in D-galactose-induced seniled mice. (x±s，n=15)
注：＃＃P＜0.01，＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with D-galactose group
3.5 銀杏黃酮對D-半乳糖致衰老模型小鼠全腦穀氨酸含量的影響