傳統微生物培養的研究方法和現代分子生物學技術是目前主要的兩大研究手段，以下是小編蒐集的一篇關於腸道微生物組的現代分子生物學研究方法探究的論文範文，歡迎閱讀檢視。
引言
微生物遍佈於人體所有與外環境相通的器官。成人胃腸道黏膜表面積達300m2,是與外界環境接觸並相互作用的最大區域，在其中定殖着約1×1014個微生物，數量是人體體細胞總數的10倍。腸道微生物參與宿主的能量吸收和儲存，幫助宿主降解並吸收食物中的營養成分，還能促進免疫細胞分化與成熟、激活腸道免疫系統[1-3],具有非常重要的生理意義。但是由於人體腸道複雜的厭氧環境，40%~80%的腸道微生物難以在體外培養，僅憑培養手段進行微生物組研究會大大削弱腸道微生物的多樣性。隨着分子生物學技術的飛速發展，利用分子生物技術研究腸道微生物組的技術取得了極大的進展。掌握並運用這些新技術對腸道微生物組的研究十分關鍵，該文主要對腸道微生物組的現代分子生物學研究方法進行總結和介紹。
1傳統純培養檢測方法
傳統微生物檢測方法是用各種培養基培養分離微生物，並透過革蘭染色、生物化學和血清學試驗等方法來確定微生物種類，透過倍比稀釋、菌落計數等方法來測定微生物數量。但由於傳統微生物培養技術中，菌株的富集或衰減不可避免，原始的微生態結構被改變，這會導致研究結果存在較大偏差。
Moore等[4]利用傳統培養方法對20例男性的糞便樣品中微生物種類和相對數量進行了研究，研究對象包括日本到夏威夷的60~80歲的健康個體，食譜包括東西方飲食，將取到的糞便樣品進行培養分析，得到1147個純培養物，鑑定爲113種不同的微生物。然而據報道，人體腸道至少存在400種微生物[4],因此這種培養方法會漏掉多數的、營養條件要求更爲苛刻的微生物。
2傳統分子生物技術
2.1腸道菌羣DNA提取技術
從糞便樣品中提取高質量的、具有代表性的腸道菌羣總DNA是腸道微生物分子生物技術研究的基礎。目前提取腸道菌羣總DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法以及一些商業試劑盒，如FastDNAkit、QuantumPrepAquapureGenomicDNAisolationkit、QIAampDNAStoolMinikit等。其中QIAampDNAStoolMinikit的提取效果得到較多肯定。試劑盒應用方便、快捷，但價格昂貴，處理大批樣品時科研成本太高。相較而言，酚/氯仿抽提法快速且成本低，適合用於腸道微生物研究中總DNA提取，尤其適合處理大批量樣品。
2.2構建基因文庫測序技術
2.2.1構建16SrRNA基因文庫
16SrRNA基因克隆文庫透過擴增各種細菌共有基因序列片段對細菌進行定性定量分析，是一種有力的細菌學檢測分析手段，現已廣泛用於腸道和人體其他部位微生物多樣性研究[5-7],並透過該方法發現了許多尚未培養到的菌種。16SrRNA基因克隆文庫技術可以分析標本中的菌羣結構，反映各種細菌的相對比例及數量，具有培養法難以比擬的優勢，不足之處是實際操作中技術環節多、影響因素複雜、不同實驗室操作條件難以標化以及對標本中的細菌數量有一定要求等。但相信隨着技術的不斷提高，16SrRNA基因序列分析將逐步成爲微生物組結構研究的有力工具。
2.2.2全基因組鳥槍測序分析技術
Gill等[8]利用全基因組鳥槍(Shot-gun)測序技術分析了兩名健康成年人糞便中的菌羣，首次對人體腸道微生物多樣性進行了全面的描述。
Qin等[9]運用深度Shot-gun測序法研究發現，Ⅱ型糖尿病患者的腸道菌羣中度失調，產丁酸鹽細菌丰度降低，而致病微生物的功能增加。相較於傳統的基於rRNA的研究，Shot-gun測序分析技術可以找到更多的進化標記，得到更多的菌羣資訊，且Shot-gun技術不需PCR擴增，因此分析出的結果偏差較小;此外，透過序列數據分析，還可以對微生物基因表達及功能狀態情況進行研究。其缺點在於微生物系統組成複雜，將大量的序列資訊正確地裝配成每個成員的基因組全序列，是一個較大的難題。
2.3遺傳指紋圖譜技術
構建基因文庫的方法可以得到樣本中的菌羣種類和相對進化資訊，然而，我們常需要對整個腸道微生物組進行動態監測，構建基因文庫方法會顯得費時、費力，不能做出快速檢測，這時遺傳指紋圖譜技術可克服上述不足，快速靈敏地檢測生態系統的動態變化。
2.3.1變性梯度凝膠電泳及其衍生技術
變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophore-sis,DGGE)技術是由Fisher等發明的，Muyzer等首次將其應用於微生物羣落結構研究，隨後Zoeten-dal將其用於人體腸道菌羣的分析研究。後來在其基礎上衍生出溫度梯度凝膠電泳(temperaturegra-dientgelelectrophesis,TGGE)、瞬時溫度梯度電泳(temporaltemperaturegradientgelelectrophesis,TTGE)、脈衝場凝膠電泳(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)和單鏈構象多態性檢測(single-strandedconformationalpolymorphisms,SSCP)等。此後，該技術被廣泛應用於消化道排泄物中微生物的分析[10-11].
DGGE及其衍生技術既可以對比分析不同的微生物羣落之間的差異，鑑別細菌種類，也可以研究同一個微生物羣落隨時間和環境改變的動態變化過程。但該技術用通用引物進行PCR擴增時，可能會忽視一些數量較少的細菌，並且腸道微生物組種類繁多，最終獲得的電泳條帶複雜且擁擠，增加了結果分析的困難。
2.3.2隨機擴增多態性
DNA技術隨機擴增多態性DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技術利用寡核苷酸序列在基因組上隨機配對的特性，經擴增得到一系列大小不同的產物，透過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳便可得到一系列基於RAPD的指紋圖譜。因爲不同模扳DNA產生的指紋圖譜有差異，因此可用於鑑定微生物種類，並且靈敏度高，常被用於細分微生物組內的種羣差異[11-12].
RAPD技術的缺點在於重複性和穩定性差，產生的圖譜條帶過於複雜，需要進行大量的篩選，從中找到較爲合適的引物進行分析，較爲費時。
2.3.3末端限制性片斷長度多態性分析技術
末端限制性片斷長度多態性分析(terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphisms,T-RFLP)技術透過自動測序儀分析酶切後的末端序列，達到定量的目的，因爲末端序列來自16SrDNA,因此可用於複雜的腸道微生物羣落結構的研究，快速靈敏地評估羣落中微生物的多樣性，並給出微生物羣落結構的指紋圖譜，是目前被廣泛採用的一種指紋圖譜技術，現已成功應用於各種微生物羣落結構和多態性的比較分析[13-14].
其缺點在於該技術只檢測末端序列，因此不可避免地會低估微生物羣落結構多態性。同時它是基於PCR擴增技術，實驗過程影響因素較多，亦會對結果造成影響。
2.4熒光原位雜交技術
除了上述技術外，分子雜交技術也被廣泛應用於腸道微生物組的研究中，同樣表現出應用潛力和優點。
Giovannoni等首次應用熒光原位雜交(fluo-rescenceinsituhybridization,FISH)技術進行細菌學的研究。隨後Delong等使用熒遊標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細胞。經過不斷的豐富和完善，FISH技術已成爲近年腸道微生物研究中一種重要的檢測工具[15-16].其利用熒光素標記16SrRNA基因序列的寡聚核苷酸探針，與靶細菌雜交，透過檢測目標序列來鑑定微生物，具有敏感、快速、安全等優點。
FISH技術還可用於鑑定和檢測未培養種屬和新種屬。其缺點在於FISH技術尚不能用於16SrRNA序列未知微生物的檢測，且在操作時易受到污染干擾，同時結果會受到微生物營養狀態的影響。
由於腸道微生物組種類繁多，而聯合流式細胞學技術可進行高通量分析，已越來越多地應用於FISH信號檢測。
3新近發展的方法技術
3.1基因芯片技術
基因芯片技術(DNAchips)原理是使探針分子在濾膜、硅片、玻璃等介質上排列成微矩陣，將待檢樣品標記後與微矩陣雜交，透過檢測樣品雜交信號強度即可獲得樣品中基因序列及數量等資訊，具有快速、高效、低成本等優點，現已廣泛應用於微生物羣落結構及功能的研究[17-19],並且其敏感性和特異性已經得到了反覆驗證[20-21].
目前尚沒有應用基因芯片進行人體腸道微生物研究的報道，但基因芯片包括大量針對人體腸道微生物的功能基因，並且其子類型HummChip是專門針對人體微生物設計的，因此基因芯片技術應用於腸道微生物研究不存在技術問題。
3.2宏基因組學技術
宏基因組學即將環境中全體微生物的遺傳物質看作一個整體，系統全面地研究微生物與其生存環境之間的關係。透過宏基因組測序技術可發現腸道菌羣結構改變，結合其代謝特徵可分析腸道微生物與代謝性疾病之間的聯繫。宏基因組學還可用來發現新發傳染病病原以及未知病原。美國國立衛生研究院(NationalInstitutesofHealth,NIH)的人類微生物組計劃[22-23]利用宏基因組學技術分析了242個美國健康志願者微生物基因組，獲得了近800個菌種的基因參考序列。
宏基因組學技術爲腸道微生物組的研究提供了新的思路與方法，爲充分認識和利用未培養微生物、完整地從羣落水平上認識微生物開闢了新的道路。
3.3第二代測序技術
2005年底Roche公司建立454測序技術，該技術結合DNA擴增乳膠和皮升級反應孔進行焦磷酸鹽測序，可對微生物多樣性、種羣結構、進化關係、功能活性、相互協作關係及與環境之間的關係進行研究，具有速度快、通量高、讀長長、準確性高、一致性好及簡便高效的優勢。
Gosalbes等[24]運用454測序技術對10位健康人的腸道微生物羣落結構和組成進行了研究，發現發現厚壁菌門佔49.18%,擬桿菌門佔31.42%,變形菌門佔3.6%,放線菌門佔0.4%.454測序技術在腸道微生態研究中已經得到較爲廣泛的運用[25],然而454測序同樣存在着缺點，主要在於片段長度短，對連續單鹼基重複區域測序準確性差，常會產生缺失或者插入誤差。但隨着454測序分析技術的`發展成熟，終將得到更準確、可靠的結果。
相較於454測序技術，Illumina測序表現出低錯誤率、低成本和高通量等優勢[26-27].但是，Illumi-na測序長度短，所獲得的序列數量巨大，呈數十倍增長，原有生物資訊學分析工具無法計算，因此解決其運算問題是Illumina用於微生物羣落分析的關鍵之處。隨着Illumina測序讀取長度的改善及新型分析工具的開發，預計Illumina測序技術將因其高性價比的優勢廣泛應用於腸道微生物組的研究。
4展望
從1975年Woese等首次應用rRNA分析菌羣以來，rRNA數據庫迅速擴大，16SrRNA基因作爲細菌的標誌，已逐漸成爲臨牀細菌分類、鑑定的金標準。傳統分子生物學技術多以16SrRNA基因爲基礎，Shot-gun測序費用高昂且分析過程繁瑣複雜，目前難以大規模推廣使用，DGGE技術相對簡單高效，T-RFLP較爲方便快捷。基因芯片用於個體間腸道菌羣對比時靈敏性較好，且具有高通量特點，預計可廣泛應用於臨牀檢驗。宏基因組測序可保留樣本中全部菌羣的資訊，在腸道菌羣多樣性研究中正逐漸盛行。焦磷酸測序能自動化檢測大量的樣本，近年來發展迅速。然而分子生物學技術均爲多學科技術融合滲透的成果，必然在某些方面存在不足和一些亟待解決的關鍵問題，且這些方法都受制於樣本中獲得的DNA質量及其PCR效果。但隨着科學技術的不斷髮展，相信這些問題會得到解決，相關技術一定會在腸道微生物的研究中發揮更加重要的作用。
總之，腸道微生物組研究主要包括微生物組的多樣性和功能活性等兩方面。傳統微生物培養的研究方法和現代分子生物學技術是目前主要的兩大研究手段，其中現代分子生物學技術具有快速、高效的特點，尤其是對於不能被培養的微生物的研究具有傳統微生物培養方法無法替代的優勢。而傳統的微生物培養方法，可透過培養、分離、鑑定獲得存活的純微生物，進而在微生物整體水平上進行研究。因此，綜合應用各種腸道微生物組的研究方法和技術才能進一步加快對腸道微生物組多樣性及其功能的研究和認識。
參考文獻
[1]SERINOM,LUCHEE,GRESS,bolicadapta-tiontoahigh-fatdietisassociatedwithachangeinthegutmicrobiota[J],2012,61(4)：543-553.
[2]SWARTZTD,SAKARY,DUCAFA,ervedad-iposityintheFischer344ratdevoidofgutmicrobiota[J]BJ,2013,27(4)：1701-1710.
[3]ROUNDJL,LEESM,LIJ,oll-likereceptor2pathwayestablishescolonizationbyacommensalofthehu-manmicrobiota[J]nce,2011,332(6032)：974-977.
[4]MOOREWEC,nfecalflora:thenormalfloraof20Japanese-Hawaiians[J]Microbiol,1974,27(5)：961-979.