1離體面板的製備
用丁香酚麻醉,剪取魚皮,去除面板外側鱗片及內側肌肉等附着物,用異丙醇擦除面板上內側多餘脂肪,經生理鹽水洗淨後將魚皮置於-20℃條件下儲存[4],備用。釋放液和接收液的配製準確稱取0.5g敵百蟲原藥,溶解於100mL蒸餾水中,用蒸餾水定容至1000mL,從中取1mL稀釋至1000mL,即得0.5mg/L的敵百蟲溶液。向該溶液中分別按要求準確加入水溶性氮酮、丙二醇和薄荷醇,配製成含不同濃度各促滲劑的敵百蟲藥物釋放液。測定發現,試驗魚體表肌肉浸出液的pH值與蒸餾水相近,故採用生理鹽水作爲體外經皮滲透試驗的接收液。體外經皮滲透試驗將雜交鱧皮固定於透皮實驗儀的Franz擴散池中,皮外側朝向給藥池,內側朝向接收池(如圖1)。向給藥池和接收池中分別加入1.3.2節配製好的釋放液和接收液。試驗組給藥池按要求分批次加入含不同促滲劑和敵百蟲的釋放液,對照組釋放液中僅含敵百蟲,接收池溶液及其他條件均一致。分別在2、3、4、6、8、10和12h於接收池中取樣5mL,檢測敵百蟲的濃度,每次取樣後補足等量的接收液。試驗水浴溫度設定爲25℃,磁力攪拌速率爲200r/min。爲模擬實際施藥環境,每次取樣後均更換給藥池的釋放液(12h取樣點除外)。數據處理根據氣相色譜測得的各時間段所採集接收液中敵百蟲的濃度,計算得到單位面積的累積滲透量(Q,μg/cm2)[5],計算公式見式。
2結果與分析
2.1標準曲線
以色譜峯面積爲縱座標(y)、進樣質量濃度爲橫座標(x)作標準曲線,得標準曲線方程爲y=5318.9x-43.216,相關係數r=0.9998,表明在0.010~1.000mg/L範圍內,敵百蟲進樣質量濃度與色譜峯面積間具有良好的線性關係。
2.2方法的回收率及檢出限
結果表明,當樣品中敵百蟲的添加水平爲0.50和0.25mg/L時,回收率分別爲95.86%和92.93%,相對標準偏差(RSD)分別爲3.31%和4.09%。計算得方法的檢出限(LOD)爲0.006mg/L。
2.3樣品雜質峯分析
試驗樣品中敵百蟲含量測定的氣相色譜圖見圖3。除在3.486min附近有主峯外,在9.223min左右出現了小的雜質峯。鑑於農業部783號公告—3—2006中[6]未提及色譜分析時敵百蟲受熱裂解成敵敵畏的問題,因此該雜質峯可能是由於敵百蟲原藥(90%)中所含雜質敵敵畏等成分造成的。
2.4體外經皮滲透試驗結果
2.4.1不同種類及不同濃度促滲劑作用下敵百蟲的經皮累積滲透量促滲劑對敵百蟲經雜交鱧皮單位面積累積滲透量(Q)的影響結果(表1)表明:2種濃度的丙二醇在各時間段內均對敵百蟲的滲透有明顯促進作用,與對照組相比差異極顯着(P<0.01),且Q值與其濃度呈正相關;體積分數爲6×10-7的水溶性氮酮在10h及12h時對敵百蟲的滲透有明顯促進作用,與對照組相比差異顯着(P<0.05),而體積分數爲1×10-2的水溶性氮酮卻表現出一定的拮抗作用,在試驗2h時與對照組相比其Q值明顯偏低且差異顯着(P<0.05);2種濃度薄荷醇對敵百蟲的滲透均無明顯影響。
2.4.2不同種類及不同濃度促滲劑作用下敵百蟲的經皮吸收速率及增滲比根據表2中吸收速率(Js)及增滲比(ER)可知,體積分數爲6×10-7的水溶性氮酮以及6×10-7和1×10-2的丙二醇對敵百蟲的經皮滲透均有促進作用,其作用由強到弱依次爲1×10-2的丙二醇>6×10-7的丙二醇>6×10-7的水溶性氮酮;而體積分數爲1×10-2的水溶性氮酮則表現爲一定的拮抗作用;1和2mg/L的薄荷醇對敵百蟲的經皮滲透無明顯影響。
3討論
面板的屏障作用易導致藥物難以到達病原寄生部位或達不到治療濃度,因此促滲劑作爲一種能促進藥物滲透作用的成分已越來越受到醫學工作者的重視[7–9]。國內外對人、畜用藥物的促滲劑已有一些研究[7–14],而應用於水產藥物的促滲劑卻鮮有報道。研究表明,魚類的面板與其他動物相似,也是由表皮和真皮層組成,這使得將醫藥及獸藥促滲劑應用於水產用藥物成爲可能[10]。Másson等[4]曾以環糊精爲促滲劑,利用Franz擴散法測定了不同種魚(鮎魚、斑點鮎魚、比目魚、鰈魚)、老鼠和蛇的面板對質量分數爲1%的鹽酸可的鬆的滲透性,結果表明,藥物經魚面板的'滲透效果比老鼠皮強100倍,比蛇皮強10000倍。由此推測,促滲劑對水產動物面板滲透作用的促進效果可能更好。本研究以雜交鱧皮作爲經皮滲透試驗用皮,透過在敵百蟲中添加不同濃度的水溶性氮酮、丙二醇和薄荷醇來增強藥物的經皮滲透作用。促滲劑試驗濃度是結合文獻報道中的常規有效濃度、敵百蟲在水產中的用藥濃度及考慮實際應用中的生產成本後確定的,其中高濃度爲文獻報道中人畜藥物的常用濃度。薄荷醇作爲促滲劑一般需經有機溶劑溶解後再添加於藥物中使用,但由於其在水中微溶,不宜將其在有機溶劑中的常用濃度應用於本研究(水體環境)中。在無相關文獻可參照的情況下,考慮到生產成本,故以接近敵百蟲的用藥濃度作爲促滲劑的低試驗濃度[8,11]。結果表明:在供試高、低2種濃度下,丙二醇對敵百蟲的增滲比分別爲1.59和1.63,促滲作用最佳;水溶性氮酮在低濃度下具有一定的促滲作用,增滲比爲1.12,而在高濃度下卻表現出一定的拮抗作用,這與胡兆農等[11]研究發現100mg/L的氮酮對30%敵百蟲乳油的殺蟲效果有拮抗作用,以及彭鬆[12]關於低濃度氮酮能夠增強藥物的滲透作用,而高濃度下反而減弱滲透作用的報道類似;薄荷醇在2種試驗濃度下均無明顯的促滲作用,可能是由於其在水中微溶,本試驗中添加的濃度較低,未達到有效促滲濃度的緣故。促滲劑的作用效果與其作用機制相關。丙二醇是一種廣泛應用的促滲劑,通常認爲其能夠增加藥物在角質層中的溶解度,提高藥物對面板的滲透性[13]。但由於魚皮表層細胞並沒有角質層,因此其可促進敵百蟲經魚皮滲透的作用機制還有待研究。氮酮是目前最常用的一類促滲劑,屬於人工合成物質,水溶性氮酮是由氮酮開發而來的水溶性製劑產品,其作用機制可能是透過增強脂質雙分子層的流動性來促進藥物透過表皮細胞的[14]。但本研究中加入高濃度氮酮後敵百蟲的經皮滲透作用反而降低,其原因也有待進一步研究。本研究表明,將促滲劑應用於水產動物給藥中是可行的,且其不僅在常規使用濃度時可表現出促滲作用,在低濃度(接近水產養殖中敵百蟲的使用濃度)時同樣具有促滲效果,這一特徵爲將促滲劑應用於其他高毒、高殘留的水產藥物提供了理論依據。但本研究未選取促滲劑的其他濃度進行試驗,因此下一步研究需完善相關濃度試驗,篩選最優促滲劑濃度。利用促滲劑配伍常規水產用藥物製成高滲透性藥劑,有望提高藥物的療效及利用率,節省用量,從而降低養殖成本和環境污染。