黃連爲毛茛科(Ranunculaceae)黃連屬CoptisSalisb.植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao 或雲連Coptis teeta Wall. 的加工品，據文獻報道，其化學成分主要爲生物鹼類物質。黃連的廣泛利用與其所含各種生物鹼的藥理作用有密切的關係，且研究表明，黃連的藥理作用並不是某單一生物鹼作用的結果，如黃連中小檗鹼具有較強的抗炎作用，但是黃連水提液的最低抑菌能力要強於小檗鹼，說明黃連中含有其他抗菌或對抗菌有協同作用的成分。所以，只有對其主要的多個生物鹼(如小檗鹼、黃連鹼、非洲防己鹼、表小檗鹼、巴馬汀等)的質量分數進行全面控制，才能保證藥材的質量。但對照品來源限制了多個生物鹼的含量控制。有研究者提出了一測多評的多指標質控模式，即在多指標質量控制時，利用中藥有效成分內在函數關係和比例關係，以藥材中對照品廉價易得的典型成分爲內標，建立該成分與其他成分間的相對校正因子，再透過校正因子同步計算出其他成分的量。在方法實施時，可在只有一個對照品的情況下，實現這些成分的同步測定，併成功應用於薄荷，五味子，白芷、丹蔘、赤芍、淫羊藿、連翹、黃芩、黃連、人蔘和枳實等藥材的質量控制，以及熱毒寧注射液、複方丹蔘、清開靈注射液等中成藥的質量控制。其中黃連藥材的一測多評方法被《中國藥典》2010 年版採用，但只對其中4 種生物鹼進行了控制。同時測定黃連中6 種生物鹼更有利於黃連藥材質量的控制。本研究採用一測多評的方法同時檢測黃連中6 種生物鹼的量，相較於《中國藥典》方法增加指標成分的種類，不受對照品來源的限制，更有利於黃連及其炮製品的.質量控制。
1 儀器與試藥
高效液相色譜儀(Waters 2695-2998，Agilent1200S，島津LC-20A);KQ5200 型超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司);CPA225D 型電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司);BS224S 型電子天平(萬分之一，德國賽多利斯公司)。對照品鹽酸巴馬汀(批號110732-200506)、鹽酸小檗鹼(批號110713-200609)由中國食品藥品檢定研究院提供;對照品鹽酸藥根鹼(質量分數96.17%)、鹽酸非洲防己鹼(質量分數96.41%)、鹽酸表小檗鹼(質量分數90.38%)、鹽酸黃連鹼(質量分數91.92%)由重慶市中藥研究院藥化室提供;乙腈爲色譜純，其餘試劑均爲分析純。黃連 Coptidis Rhizoma 藥材(批號2008004、080803、080805、080804、2008005、20120905、080810、2008008、2008007、2008006)，黃連飲片Coptidis Rhizoma decoction pieces(批號20080501、0808003、080802、080801、0801101、0809021、0803180、060401、2008007、0801005、08031801、080101)，酒黃連Coptidis Rhizoma stir-fried withwine(批號071224、080301、080301、071124、080805、080301、08032101、080401、080804、20081001)，萸黃連Coptidis Rhizoma stir-fried withEvodiae Fructus(批號20080301、080313、071201、080301、080805、080301、08032101、20080401、080804 、20081001 )， 薑黃連Coptidis RhizomaStir-fried with ginger juice(批號080301、080313、080804、08032101、071130、080401、080301、080803、080805、20081001)，以上藥材及炮製品均由太極集團有限公司提供;雲連Coptis teeta Wall.和三角葉黃連Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao(雅連)自採，各3 批，以上藥材均由江西中醫藥大學鍾國躍研究員鑑定。
2 方法與結果
2.1 一測多評方法學考察
2.1.1 對照品溶液的配製
精密稱取鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼各適量，用50%乙腈製成含有11.13 μg/mL 鹽酸藥根鹼、15.2 μg/mL 非洲防己鹼、52.77 μg/mL 鹽酸表小檗鹼、100.93 μg/mL 鹽酸黃連鹼、75.32 μg/mL 鹽酸巴馬汀、284.2 μg/mL 鹽酸小檗鹼的混合對照品溶液。
2.1.2 供試品溶液的製備
取藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙腈-鹽酸(100∶1)50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用50%乙腈-鹽酸(100∶1)補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL，置10 mL 量瓶中，加各溶劑至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。
2.1.3 色譜條件
色譜柱爲Gemini-NX C18(250mm×4.6 mm，5 μm);流動相爲乙腈-0.25 mol/L 乙酸銨和8 mmol/L 十二烷基硫酸鈉(SDS)水溶液(氨水調節pH 值爲9.3)(36∶64);柱溫35 ℃;體積流量1 mL/min;檢測波長270 nm;進樣量10 μL。上述色譜條件下，鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼分離良好，各組分的理論塔板數均>7 500。
2.1.4 線性關係的考察
將混合對照品溶液依次稀釋2、4、8、16、32、160 倍，精密吸取混合對照品溶液及其稀釋液各10 μL 進樣。以進樣量對峯面積積分值進行線性迴歸處理，得鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼的迴歸直線方程及線性範圍。
2.1.5 精密度試驗
取鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼混合對照品溶液，各重複進樣6 次，測得鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗鹼平均峯面積的RSD 依次爲0.59%、0.37%、0.44%、0.20%、0.28%、0.14%。表明有較好的精密度。
2.1.6 重複性試驗
取同一批次的樣品6 份，照上述制定的方法制備供試品溶液和進行HPLC 測定，測得鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗鹼的平均質量分數依次爲0.50%、0.45%、1.13%、2.38%、1.68%、7.20%，RSD 依次爲1.00%、0.91%、0.76%、0.49%、0.69%、0.36%。表明該法重複性良好。
2.1.7 穩定性試驗
取同一供試品溶液，分別於0、2、4、8、12、24 h 測定峯面積，結果鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗鹼的RSD依次爲0.81%、0.96%、0.57%、0.40%、0.43%、0.15%。說明供試品溶液在24 h 內穩定。
2.1.8 加樣回收率試驗
精密稱取適量已測定的黃連藥材粉末約0.1 g，精密稱定，共6 份，加入混合對照品溶液適量，按供試品製備方法制備樣品進行HPLC 測定，計算回收率。結果鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼的平均回收率依次爲99.65%、98.59%、98.49%、98.66%、98.64%、98.63%，RSD依次爲0.03%、0.15%、0.21%、0.12%、0.28%、0.23%。
2.2 相對校正因子的確定
2.2.1 相對校正因子計算
以鹽酸小檗鹼爲內標(S)，分別計算鹽酸小檗鹼(berberine hydrochloride，B)對鹽酸藥根鹼(jatrorrhizine hydrochloride，J)、鹽酸非洲防己鹼(columbamine hydrochloride，C1)、鹽酸表小檗鹼(epiberberine hydrochloride，E)、鹽酸黃連鹼(coptisine hydrochloride，C2)、鹽酸巴馬汀(palmatine hydrochloride，P)的相對校正因子(fs/k)，結果見表2。2.2.2 相對校正因子的重現性考察考察了3種高效液相色譜系統：Waters 2695-2998、島津LC-20A 和Agilent 1200S 型高效液相色譜儀和3 種色譜柱：Gemini-NX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，XtimateTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，BETASIL C18(250mm×4.6 mm，5 μm)並進行了不同實驗室的考察，鹽酸小檗鹼對鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀的fs/k 均基本一致，RSD 小於2%，其結果比較穩定可靠。
2.2.3 待測組分色譜峯的定位
利用相對保留值(rk/s)定性，測得鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼的rk/s ，RSD≤5%，表明利用rk/s 進行峯的定位可行。rk/s=tR(k)/tR(s)k 爲待測組分，s 爲對照物。
2.3 一測多評法和外標法的比較
取各批次黃連及其炮製品樣品粉末，按照供試品溶液的製備方法制備樣品，分別注入液相色譜儀，測定樣品中鹽酸藥根鹼、鹽酸非洲防己鹼、鹽酸表小檗鹼、鹽酸黃連鹼、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗鹼含量;並運用小檗鹼對藥根鹼、非洲防己鹼、表小檗鹼、黃連鹼、巴馬汀的相對校正因子計算藥根鹼、非洲防己鹼、表小檗鹼、黃連鹼、巴馬汀的量，各批次每個樣品測定3 次，取均值，再計算各類型黃連及其炮製品的總平均值。將一測多評與外標法得到的量值進行比較，2 種方法所得值的偏差都在3%以內，由此說明一測多評法用於黃連藥材及炮製品的多成分質量評價研究是可行的。
3 討論
黃連供試品製備方法中對溶媒種類進行了考察，文獻中黃連的提取溶媒多用甲醇或甲醇-鹽酸，在黃連質量標準研究中，發現50%乙腈對生物鹼的溶解度較大，因此，對比了甲醇與50%乙腈做溶媒對黃連中主要生物鹼質量分數的影響，結果表明50%乙腈-鹽酸(100∶1)爲提取溶劑時6 種生物鹼質量分數較高。《中國藥典》2010 年版一部對黃連制定了4 種生物鹼的量限度，但文獻已有關於黃連中5 種或5種以上生物鹼HPLC 法同時測定的報道，其中包括木蘭花鹼、Groenlandicine、藥根鹼、非洲防己鹼等;多成分測定符合中藥多成分的特點，有利於中藥質量控制的整體性和客觀性。因此，本課題組考察了流動相系統，建立了分離度及對稱因子都較好且穩定的6 種生物鹼測定的HPLC 方法;在對其檢測波長的選擇上，參考文獻和PDA 檢測器主要生物鹼的紫外吸收圖譜，6 種生物鹼在270 nm 及345 nm處均有最大吸收，但考慮到木蘭鹼在345 nm 下無吸收，而在270 nm 下，出峯數量較多且基線穩定;因此，檢測波長定爲270 nm。
爲防止上述各項測定結果出現遠離均數的極端值，分別採用統計方法中的格拉布斯(Grubbs)檢驗法和狄克遜(Dixon)檢驗法對黃連6 種生物鹼量的最大值和最小值進行檢驗，捨去可疑值;並採用各生物鹼均值的20%下限制定其質量分數限度，黃連及其炮製品的不合格數據基本集中於同一來源的藥材，其量差異與藥材的產地和炮製習慣有關。雅連和雲連中生物鹼成分的量與味連相比差異較大，其藥根鹼量較高，約爲味連中藥根鹼量的2倍;但其非洲防己鹼、表小檗鹼、巴馬汀量較味連低;黃連鹼量與味連一致。故在確定黃連生物鹼限度時，未將二者計算在內，單獨列出，加以區分。
本研究6 種生物鹼的測定方法，與《中國藥典》2010 年版一部黃連的測定方法相比，符合中藥多成分的特點，有利於中藥質量控制的整體性和客觀性，更符合中藥質量控制方法的要求，對黃連及其相關產品的質量控制具有重要意義。