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課題名稱：內鏡生物膜現狀調研及手工刷洗效果的研究
一、文獻綜述與調研報告：(闡述課題研究的現狀及發展趨勢，本課題研究的意義和價值、參考文獻)
隨着內鏡技術的飛速發展，透過內鏡進行檢查及治療已廣泛應用於臨牀。由於內鏡屬於重複使用的醫療器械，國家2004年頒佈的《內鏡清洗消毒技術操作規範》[1] 要求使用後的內鏡必須按照要求經過高水平消毒合格後方能用於其它患者。高水平消毒主要分爲清洗(水洗和清洗劑浸泡)和消毒兩大步驟：水洗是透過手工刷洗的方法對內鏡進行初步的清潔，清洗劑浸泡是透過清洗劑的灌流清除內鏡生物負荷，高水平消毒是使用消毒劑進行灌流處理使之達到高水平消毒的效果。
但由於臨牀內鏡使用的高週轉率、內鏡本身結構精密度高、結構複雜、材質特殊，多數不耐高溫、易腐蝕，使用後微生物和有機物殘留，給使用後內鏡的清洗、消毒帶來困難，容易形成生物膜(Biofilm)。生物膜是微生物透過嵌入自身分泌的胞外多聚體物質(Extracellular Polymeric Substances，EPS )而形成的不可逆的、緊密結合的結構羣體，附着在有或無生命物體表面，並且表現爲生長速率、基因轉錄和表型的改變[2-4]。由於生物膜對外界環境的抵抗力強，影響清洗消毒的效果，是造成消毒失敗和患者感染的重要原因。
國內外的醫學專家、研究學者對生物膜已進行了大量的實驗研究，現將與內鏡生物膜清除相關的國內外研究概況敘述如下:
國外研究概況：
1. 內鏡生物膜相關感染日益受到重視，但缺乏統一明確的內鏡清洗規範。
近年來，各國紛紛出臺內鏡清洗消毒及感染控制的臨牀指南和規範[5-12，社會、公衆對於內鏡清洗消毒失敗的關注，也增加了臨牀內鏡機構對於規範的遵從性、重視度[10] 。但是規範和指南對手工刷洗和清洗劑浸泡等具體步驟未能有明確的說明。法國健康產品安全署(The French Agency for Safety of Health Products, AFSSAPS)頒佈的規範[6]定了刷洗的時間不能少於10min。美國消化護士學會(the Society of Gastroenterology Nurses and Associates, Inc. SGNA)2010年最新頒佈的標準中只規定了使用合適規格的清洗刷對內鏡管道進行刷洗直至沒有肉眼可見的污物。[11]美國食品與藥物管理局(the U.S. Food and Drug Administration, FDA, U.S.)關於內鏡自動清洗機的指南中卻提到，某公司生產的自動清洗機在機洗步驟之前只需進行牀邊預處理，無需進行手工刷洗步驟。[12]
FRANK M. MOSES和JENNIFER S. LEE對美國內鏡機構的調查發現實行手工刷洗和清洗劑清洗的佔70%;存在重複使用一次性內鏡清洗刷的佔66%;對鉗子管道刷洗一次、二次、三～五次、>五次的比例分別爲21%、35%、37%、4%。[13]究其原因，都是由於規範未闡述手工刷洗過程中清洗刷的選擇，刷洗的次數、時間、速度等重要步驟，說明較爲模糊，導致各內鏡機構手工刷洗方法的巨大差異性，清洗效果也無法得到保證。
2. 手工刷洗的作用對於預防生物膜形成及其清除的相關研究尚缺乏。
手工刷洗能夠有效的清除內鏡管道污染物已經被證實，Timothy S Charlton使用4種不同類型的清洗刷對內鏡管道進行刷洗實驗，結果顯示刷洗步驟能夠清除新的內鏡管道中52%～96%的污染物和舊的內鏡管道中73%～85%的污染物，不同的清洗刷對污染物的清除效果也不相同。[14]
但是不同結構、不同型號的清洗刷對於內鏡管道的手工刷洗效果尚未被比較與證實。由於生物膜都是牢固附着在內鏡管道壁上，且更易於附着在損傷的管道部位，使得清除生物膜的難度大大增加。注氣注水管道由於結構及管道細小無法進行機械清洗，而只能透過清洗劑和消毒劑的灌注達到清洗消毒作用，因此較鉗子管道更容易形成生物膜，這在A. Pajkos等[15]對內鏡管道進行的檢測中也被證實。由此可見，有無實施手工刷洗對生物膜的清除是有其實際意義的。對於手工刷洗作用的研究，爲內鏡管道生物膜的預防和清除帶來比清洗劑和消毒劑效果更佳的可能。
3. 內鏡生物膜的存在經小樣本實驗檢測證實，但無現狀調研及相關因素分析。
Tom Coenye等[16]的研究估計人類感染的65-80%是與生物膜相關的。Linda Bisset等[17]對高水平消毒後且細菌培養爲陰性的109條內鏡進行PCR檢測，發現有40%的內鏡鉗子管道有大腸桿菌DNA殘留，提示這些內鏡可能有生物膜的形成。同樣在A. Pajkos等[15]對正在臨牀使用的13條內鏡管道的檢測中發現，有5條的活檢吸引管道和12條注氣注水管道形成了生物膜，其中9條尤爲嚴重。內鏡管腔表面的光滑程度與否對於污染物的黏附殘留非常重要，如果管腔等的表面有縱向劃痕，會導致球菌的積聚。[18]
對內鏡生物膜使用臨牀調研的方法，開展調查問卷與實驗室檢測，瞭解生物膜的形成與內鏡臨牀使用、清洗消毒間關係的有關研究尚缺乏。
4. 執行嚴格而有效的清洗流程是預防內鏡生物膜形成的重要條件。
生物膜在內鏡管道中的形成不乏報道，Linda Bisset[17]和A. Pajkos[15]的實驗報道中內鏡生物膜的發生率分別爲40%和92%。有學者認爲，透過清洗步驟就能夠降低細菌生物膜在內鏡管道中形成的機率。[19,20]歐洲消化內鏡協會(European Society for Gynaecological Endoscopy, ESGE)頒佈的《清潔和消毒技術說明》(2003)[5]指出，清洗是整個內鏡清洗消毒流程中最爲關鍵的步驟。如果手工刷洗的步驟沒有有效的實施，殘留在內鏡管道中的蛋白質由於消毒劑得固定作用而促進生物膜形成，殘留在管道內的有機物會影響消毒劑的消毒作用而最終導致消毒的失敗[21]。不徹底的清洗與消毒間互爲因果、惡性循環，導致生物膜的形成而引發內鏡相關感染的發生。一旦生物膜在內鏡管道中形成，僅使用常規的清洗消毒方法是無法將其有效去除的。[15]
因此，有效的消毒必須以合格的清洗爲前提，這對於預防內鏡生物膜的形成具有重要意義。內鏡管道內成熟生物膜的強抵抗性會導致常規清洗和消毒的無效，引發一系列的醫院感染問題。
5. 有效的清洗對生物膜的清除作用受到普遍重視。
對於生物膜的清除，美國APIC(The Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology, Inc)指南[9]指出，能夠減少生物膜的形成和活性對於減少內鏡相關感染尤爲重要，並強調徹底手工刷洗對此的重要性。Karine Marion等[22]的血液透析裝置生物膜沾染實驗表明，與消毒劑比較，生物膜的清除應該更重視清洗的作用。Jaeeun Kim等[23]的研究表明，生物膜中的大腸桿菌對含氯消毒劑的敏感性比浮游的大腸桿菌下降了8300倍。對於成熟的生物膜，使用含有季胺類化合物的消毒劑不僅不能去除生物膜，反而將生物膜固定於內鏡表面，導致其更不易於被清除。[20]Karen Vickery等[24]的實驗研究表明，不同的清洗劑能夠清除內鏡管道上0～65%的生物膜，其中不含酶的清洗劑Matrix能夠完全清除生物膜中的細菌和EPS。由此可見，內鏡清洗消毒的兩大步驟中，清洗對成熟生物膜的清除作用是更爲主要的。
6. 生物膜形成機制的基礎研究較爲豐富，但是未能爲預防生物膜及其清除形成提供依據。
生物膜最初由自由遊動的細菌黏附在內鏡管道表面，細胞與細胞間形成柱狀和蘑菇狀的信號交流結構，液體能夠在周圍循環。該結構使細菌最大程度的暴露在流動的營養下，而且減少了細胞廢棄物的堆積。對於這些形成機制的研究，國外有細菌黏附機制[25，26]、微菌落結構機制[27]、飢餓相關抵抗機制、細胞間信號傳遞[28]以及特異基因表達[29，30]等理論已較爲完善。
基於這些理論基礎，大量的臨牀和科學實驗應用於探究對生物膜的清除效果影響的研究。D. Lindsay在回顧了大量文獻後，總結了目前控制生物膜的方法，包括：防止最初的'微生物附着、抑制生物膜的形成、針對性的清除EPS和改變檢測的方案等[4]。但是尚未有較好的、確切的解決該問題的方法，因爲生物膜對外界抵抗作用是複雜的、多因素的，當其暴露在不良環境中，其本身的結構即朝着抵抗該環境和抵抗微生物製劑的方向變異，這些因素都增加了實驗研究的困難程度[31]。因此仍未能有較好的、確切的解決該問題的方法。
國內研究概況：
1. 內鏡技術發展及使用普及，醫院感染控制重視不足。
在上海，平均每30位住院病人或每70個門診就診病人中就有1人接受內鏡檢查[32]，且該項比例仍在上升。部分醫院存在日診量過高，內鏡數量相對不足的矛盾，造成了內鏡清洗消毒時間不夠，消毒效果不達標等問題[33]。我國醫療機構普遍存在對內鏡清洗消毒重視度不夠、資源限制、對規範執行力不強等不良現象，導致了內鏡消毒合格率普遍偏低[34]的結果。由此可見，我國目前的內鏡清洗消毒工作仍然存在許多問題，發生醫院感染的隱患普遍存在。
2. 生物膜相關研究較多，但有關內鏡生物膜相關研究較少。
在對國內文獻進行檢索時，有關細菌生物膜的研究報道很多，但多爲相關研究進展的報道。還有一些對其他醫療器械形成的生物膜實驗研究，基本上都是體外進行，未能合理考慮臨牀實際情況。葛新[35，36]和陸燁[37等的報道均爲不同細菌生物膜對消毒劑的抵抗作用，其結果都與國外研究結果相似。曹勇的不同內鏡洗滌劑對內鏡管腔大腸桿菌生物膜清除力比較的實驗研究[38]，其研究結果與Vickery K等[24]的研究結果一致，即非含酶清洗劑對生物膜的清除效果較含酶清洗劑更佳。部分研究使用的材料並非臨牀內鏡材料，不能代表臨牀內鏡生物膜的真實情況。[37]
綜上，目前國內尚缺乏有關內鏡生物膜發生原因及相關因素的調查研究。 同時透過手工刷洗對內鏡生物膜進行干預的實驗性研究目前國內外均尚未見報道。
基於上述研究現狀和需要，本項研究將在前期工作的基礎上(內鏡生物膜模型的建立和不同清洗劑清除內鏡生物膜的實驗研究)，繼續深入研究手工刷洗方法對內鏡生物膜的清除效果。首先開展臨牀內鏡生物膜現狀調研及相關因素的分析，瞭解內鏡生物膜污染現狀及污染原因， 爲透過清洗、消毒來防止生物膜的形成提供 解決問題的方向和科學有效的指導，從而更好的防止內鏡相關醫院感染，保障醫療安全。 再透過對臨牀使用後的內鏡和製作的內鏡生物膜模型分別進行干預處理，同時對不同干預種類、次數等水平進行不同設定，採用內鏡常規處理措施的多因素多水平的干預，分析手工刷洗方法對內鏡生物膜的清除效果 。由於接近臨牀實際，對內鏡的清洗消毒具有切實可行的指導意義，爲透過臨牀內鏡的有效清洗來防止生物膜的形成提供可靠的理論依據。
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二、課題的基本內容，預計解決的難題
課題的基本內容：
1. 臨牀內鏡生物膜現狀調研;
2. 不同手工刷洗方法對內鏡生物膜的清洗效果。
預計要解決的難題：如何去控制手工刷洗人爲因素的一致性，防止因爲操作而產生的偏倚。
三、課題的研究方法 、技術路線
1. 臨牀內鏡生物膜現狀調研
(1) 調研對象的選取
① 調研對象：選取送往內鏡維修點維修的內鏡鉗子管道。
② 選擇標準：臨牀中使用過的內鏡鉗子管道;內鏡鉗子管道管腔儲存完好，無人爲刮擦及損壞。
③ 樣本收集例數：根據?=0.5(預期的現患率),?=0.05(參考值範圍),?=0.03(允許誤差),全國範圍內收集1068例樣本，每例樣本長度爲20cm。
(2) 調研方法
① 收集方法：在維修點內維修更換的內鏡鉗子管道，由維修中心固定工作人員隨機截取20cm。
② 送維修內鏡鉗子管道一般資料表格的設計：紙質問卷發放和電話調查相結合。
③ 問卷結果分析：瞭解全國臨牀內鏡生物膜發生率;找出臨牀內鏡生物膜產生的原因;分析內鏡在臨牀的使用情況與生物膜形成間的關係;分析不同等級醫院、不同清洗消毒情況等因素對生物膜形成的影響。
④ 激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)觀察：對收集到的內鏡鉗子管道進行熒光染色後使用CLSM觀察生物膜形成的有無和程度、管道有無刮痕和裂縫，分析整個生物膜的分佈均勻與否。
⑤ 結晶紫染色(Crystal Violet Stain)觀察：將收集到的內鏡鉗子管道隨機截取2cm一段，用0.25%結晶紫液染色5min，縱行切開後使用連接有攝像機的光學顯微鏡進行觀察。每一樣本取六張照片，生物膜的覆蓋率使用Scion圖像處理軟件進行計算。
2. 不同機械清洗方法對內鏡生物膜的清除效果比較
(1) 研究對象
① 選擇製作內鏡材料的特氟龍(Teflon)管，直徑4mm，長度200cm，環氧乙烷滅菌後備用。
② 分組方法
Ⅰ組：滅菌水空白對照;
Ⅱ組：Olympus可重複使用內鏡清洗刷;
Ⅲ組：Ruhof一次性使用含酶內鏡清洗刷;
Ⅳ組：Pull Thru一次性使用內鏡清洗刷。
③ Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別刷洗1次、2次、3次。
(2) 研究因素
① 來自於Olympus公司生產的統一規格、批號、日期的可重複使用內鏡清洗刷。
② 來自於Ruhof公司生產的統一規格、批號、日期的一次性使用含酶內鏡清洗刷。
③ 來自於Pull Thru公司生產的統一規格、批號、日期的一次性使用內鏡清洗刷。
(3) 研究方法
① 建立內鏡生物膜模型
a) 培養臨牀分離的大腸桿菌：取少量斜面保種的大腸埃希氏菌菌株,接種於無菌Muller-Hinton肉湯培養基獲得純種菌液。
b) 製作大腸桿菌菌懸液：用傾注平板法,調整細菌濃度爲106CFU/ml備用。
c) 製作的細菌濃度爲106CFU/ml大腸桿菌菌懸液與大腸桿菌培養基以10：1比例混合，放入滅菌的500ml的玻璃瓶內，持續37℃恆溫灌流Teflon管腔;蠕動泵控制速度在80~100ml∕h，以模擬臨牀操作中內鏡污染的條件，持續灌流10天，每日更換大腸桿菌菌懸液和培養基。實驗重複5次，每次試驗用的Teflon管在恆溫箱中以同樣方式盤放。
② 使用不同機械清洗方法對內鏡生物膜進行處理
a) 持續灌流10天后，取出Teflon管，排空管腔內的灌流液，用浸有75%酒精的無菌紗布擦乾Teflon管外表面。棄去Teflon管的兩端各5cm，用無菌手術刀片以Ⅰ組16cm，Ⅱ組16cm(a)、16cm(b)、16cm(c)，Ⅲ組16cm(d)、16cm(e)、16cm(f)，Ⅳ組16cm(g)、16cm(h)、16cm(i)，分段切開並標記。
b) Ⅰ組爲空白對照組，放入盛有無菌PBS的容器中進行沖洗，輕輕翻轉容器5次，棄去PBS液,用吸管吸取殘餘的溶液，重複3次後取出，洗掉浮游菌，用無菌幹紗布吸淨多餘液體。將準備好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管內管腔，使用ATP生物熒光法檢測有機物殘餘量。用無菌手術刀片將長16cm的管腔分別切爲5段3cm和1段1cm長的Teflon管。
c) Ⅱ組爲Olympus清洗刷組，Teflon管a、Teflon管b、Teflon管c分別浸泡在盛有無菌PBS的容器中各刷洗一次、二次、三次。刷完後每段Teflon管分別放入盛有無菌PBS的容器中進行沖洗，輕輕翻轉容器5次，棄去PBS液,用吸管吸取殘餘的溶液，重複3次後取出，洗掉浮游菌，無菌幹紗布吸淨多餘液體。將準備好的Ultrasnap拭子擦拭Teflon管內管腔，使用ATP生物熒光法檢測有機物殘餘量。用無菌手術刀片將長16cm的管腔分別切爲5段3cm和1段1cm長的Teflon管。
d) 3cm長的Teflon管爲收集管腔內的細菌，試驗管縱向切開等分爲兩部分，每段管腔的內表面用一個2mm寬的消毒小木棒進行擦刮，與擦刮棒一起放入盛有5mlPBS的試管中。這5個試管先進行超聲水浴10min(42~47KH、20℃)，然後使用漩渦振盪器振盪1min。振盪後的懸浮液。
e) 振盪後的液體進行梯度稀釋並重復接種3個平板，37℃培養48h後進行細菌菌落學計數。
f) 1cm長的Teflon管行熒光染色後進行CLSM檢查。
d) Teflon管Ⅲ組和Ⅳ組處理方法同Ⅱ組。
(4) 評價方法
① 細菌菌落計數：收集後的菌液進行細菌梯度稀釋。經震盪混勻器充分震盪均勻後的液體取1ml接種至直徑90mm的無菌平皿，每個平皿分別倒入無菌的45℃-48℃營養瓊脂15ml-18ml，邊傾注邊搖勻。待瓊脂凝固，於37℃培養箱內培養24h後計數。培養後觀察菌落生長情況,記錄平板菌落數,計算細菌總數(菌落數/鏡=2個平皿菌落數平均值×2)。細菌計數的結果用實際菌落數的常用對數(log cfu/cm3)爲標準菌落計數單位來表達。菌落計數換算爲標準菌落計數單位。實際菌落數(cfu/cm3)=肉眼可計菌落數×稀釋倍數/體積，取實際菌落數的常用對數(log cfu/cm3)爲標準菌落計數單位。
② ATP生物熒光法檢測：準備好Ultrasnap拭子並確定其外表面乾淨且乾燥。開啟蓋子，將Ultrasnap拭子放入ATP生物熒光法檢測儀中後關閉蓋子。開始檢測，15s後觀察結果讀數。結果判斷：0~45RLU爲合格，≥46RLU爲不合格。
③ CLSM檢測。
(5) 統計學處理：應用SPSS 13.0 軟件進行處理,同種處理因素不同水平採用方差分析中的one-way ANOVA進行檢驗,不同處理因素間的兩兩比較採用LSD-t檢驗。
四、研究工作條件和基礎
××醫科大學內科消化學組始建於50年代。1955年引進了硬式胃鏡，1957年開展了軟式胃鏡，1973年在國內率先開展了纖維結腸鏡檢查。在70年代初成立了消化專科的同時，成立了生化實驗室，1979年組建全軍消化醫學專科中心後，先後建立了微生態實驗室及病理檢驗室，開展了厭氧菌培養和腸道菌羣分析，1990年初增建了相對獨立的細胞培養室、分子生物學實驗室、胃腸激素室，使消化內科實驗室成爲初具規模、在國內消化界有較大影響力的臨牀實驗室。
現該實驗室爲全國重點學科的中心實驗室，先後完成了國家自然基金課題10項;軍隊重點攻關和廣東省各類基金20餘項。本實驗室現有面積約420平方米，擁有細胞培養及小動物室等多個相對的獨立實驗室和三個無菌工作間，現已具備：紫外-可見分光光度計(BIO-RAD)、超淨工作臺、CO2培養箱、空氣浴與水浴搖牀、生化免疫、病理、分子生物學、胃腸激索、微生態等實驗室。配有PCR擴增儀，顯微圖像分析儀、熒光分光光度計、-80℃低溫冰箱、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、低溫超速離心機、Bio-Rad酶標儀、低溫高速離心機、微量高速離心機、核酸定量儀、ScanArray5000掃描儀、各種電泳裝置、核酸轉移裝置、等主要試驗用儀器，是國內唯一能開展多種需氧及厭氧菌培養的臨牀實驗室，均狀態良好，執行正常。
××醫院中心實驗室、校本部實驗室，設備先進、技術力量雄厚，P級實驗室、共聚焦顯微鏡等儀器，在本課題需要時可隨時使用。
研究基礎：
前期工作中，我們參考了國內外大量文獻，進行了內鏡生物膜模型的建立和不同清洗劑清除內鏡生物膜的實驗研究。
其中內鏡生物膜模型的建立透過大腸桿菌在內鏡Teflon管上生物膜的形成與培養時間、流速、溫度的關係，研究形成了成熟穩定的黏附於內鏡Teflon管上的生物膜。研究發現細菌更容易在Teflon管超微結構上微小的溝紋縫隙中積聚，因此在這些縫隙中更易形成生物膜，提示在內鏡的手工清洗中要注意選擇合適的刷子及適當的刷洗方式，以免劃傷內鏡管腔的內表面，從而降低細菌的黏附。
五、計劃進度
起止日期 論文工作進度(主要內容、完成要求)
20XX.12-20XX.02 準備實驗用品，進行臨牀內鏡管道的收集及評價
20XX.03-20XX.06 進行手工刷洗對內鏡生物膜清洗效果的處理並收集數據
20XX.07-20XX.08 數據整理，統計分析
20XX.9-20XX.11 完成課題，撰寫論文
20XX.06 畢業答辯