澱粉顆粒中形成結晶區的主要爲支鏈澱粉，支鏈澱粉分子相互聚集形成的雙螺旋結構是結晶的基礎，下面是小編蒐集整理的複合微生物發酵方法結合色譜檢測技術分析的論文範文，供大家閱讀了解。
澱粉是由脫水葡萄糖單位構成的生物高聚物，大部分是以澱粉顆粒的形態存在，不論來自何種植物或組織，都包含2種主要的多糖，即直鏈澱粉和支鏈澱粉。直鏈澱粉通常被定義爲線性長鏈分子，是由脫水葡萄糖單位經過α-1，4糖苷鍵連接而成的，而支鏈澱粉是由葡萄糖經過α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵連接而成，即由許多短鏈在還原端透過α-1，6糖苷鍵連接在一起，使支鏈澱粉具有高度的分支。由於直鏈澱粉和支鏈澱粉的結構不同，且在澱粉中的含量不同，所以決定各類澱粉的結構和性質的差異。
澱粉顆粒是一種半結晶的聚合物，其包含有結晶區和無定形區。澱粉顆粒中形成結晶區的主要爲支鏈澱粉，支鏈澱粉分子相互聚集形成的雙螺旋結構是結晶的基礎。而直鏈澱粉是組成澱粉顆粒無定形區的主要成分。然而在高直鏈澱粉品種下，澱粉分子是如何影響澱粉顆粒的結構的，目前仍不是十分清楚。
這主要是由兩方面的原因造成的：一是缺乏更爲有效的技術;二是澱粉降解模型的設計上需要更科學化。
雖然已有許多透過酶降解體系來研究澱粉結構，例如分析降解前後澱粉顆粒形態和分子結構的變化等，然而採用不同的方法和技術分析澱粉的結構仍顯得十分必要。本試驗採用複合微生物發酵的方法結合色譜檢測技術，試圖從不同的角度來研究澱粉的精細結構。
1試驗材料和方法
1.1試驗材料
普通玉米澱粉，購於Sigma公司(美國);高直鏈玉米澱粉，來源於國民澱粉公司(澳大利亞);其他試劑都爲化學分析純度。
1.2試驗方法
1.2.1澱粉蒸煮
玉米澱粉的蒸煮處理：將澱粉與蒸餾水相混合製成水分含量爲60%的澱粉乳，置於高壓鍋中於121℃處理30min，冷卻後重複高壓處理兩次。取出後冷卻，冷凍乾燥，將乾燥後得到的固體經粉碎機粉碎後過0.5mm的篩網。
1.2.2微生物發酵處理
利用微生物發酵法降解普通玉米澱粉和高直鏈玉米澱粉，對其降解前後的分子結構進行分析。具體的試驗過程爲：利用磷酸緩衝液將來源於健康人體糞便製備成固形物10g/mL的腸道微生物混合菌液，用於體系發酵。取200mg澱粉樣品底物加入到含有9mL發酵介質的發酵瓶中並水合1h(溫度控制在4℃)。發酵介質包含以下物質(每1L蒸餾水)：2.5g胰蛋白酶、125μL礦物質溶液(每1L蒸餾水中132gCaCl2·2H2O，100gMnCl2·4H2O，10gCoCl2·6H2O，80gFeCl3·6H2O)、250mL緩衝溶液(每1L蒸餾水中4g(NH4)HCO3、35gNaHCO3)、250mL礦物質溶液(每1L蒸餾水中5.7gNa2HPO4，0.6gMgSO4·7H2O)和1.25mL刃天青溶液0.1g/mL。取33.5mL滅菌後的還原性溶液(每1L蒸餾水中6.25g半胱氨酸鹽酸鹽，6.25gNa2S·9H2O，40mLNaOH)添加到1L發酵介質中，發酵介質的pH調整到7.2。每個發酵瓶接種1mL的微生物混合菌液，每毫升混合菌液中含有1×1010活菌，最終保證達到每個發酵瓶中含有1×109活菌。每個試驗瓶中用氮氣噴霧，並用石蠟密封作爲防止泄露的預防措施。試驗瓶在37℃振盪中培養24h，發酵結束後立即冷凍貯藏。
1.2.3利用HPLC分析2種澱粉的分子組成取不同發酵時間段的發酵液冷凍乾燥，取固形物50mg放入25mL離心管中，向其中加入8mL二甲亞碸(DMSO)和水的混合液(DMSO與H2O的體積比爲90∶10)。每隻離心管封蓋，置於沸水浴中加熱30min，冷卻後加入20mL無水乙醇，封蓋後均勻震盪3min，靜置5min後於3000r/min條件下離心，棄去上清液，加入20mL無水乙醇再次震盪離心。再次用乙醇洗滌重複操作得澱粉沉澱物。
取15mg該澱粉沉澱物，用0.5mL0.2mol/L的NaOH溶液溶解該澱粉，震盪混合10s。向所得溶液中加入0.5mL0.05mol/L的乙酸鈉緩衝液(pH4.0)進行中和，然後加入離子交換樹脂(0.20g，BioRadAG?
501-X8，Hercules，USA)，並於50℃水浴鍋中保持1.5h。於10000r/min離心10min後，得上清液，進行HPLC分析(LC1150，GBCInstruments，Vic，澳大利亞)。色譜柱爲UltrahydrogelTM250柱和保護柱(7.8mm×300mm，Waters，日本)，檢測器爲蒸發光散射檢測器(ELSD)(ALLTech，Deerfield，美國)。流動相爲0.05mol/L的醋酸銨緩衝溶液(pH5.2)。
1.2.4掃描電子顯微鏡(SEM)觀測澱粉顆粒的形態。取不同發酵階段的發酵液，經冷凍乾燥、粉碎後，均勻地撒在貼有雙面膠的樣品面盤上，用Hitachi1B-3離子塗布器噴金固定，然後利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察並記錄顆粒形態。發酵前的澱粉樣品直接用SEM觀察並與前者進行比較。每種澱粉樣品至少記錄3次顆粒形態。
2結果與討論
2.1澱粉分子的色譜圖
2.1.1發酵前2種澱粉分子色譜圖的比較
對於普通玉米澱粉，其分子主要由2個組分組成，即大分子的支鏈澱粉和相對分子量較低的直鏈澱粉，其中支鏈澱粉佔較大比例;而對於高直鏈玉米澱粉，液相色譜圖(圖1b)顯示其是由3個組分所組成，分別爲大分子的支鏈澱粉、相對分子量較低的直鏈澱粉以及更低分子量的直鏈澱粉。爲了便於理解，本試驗將直鏈澱粉的這兩個組分分別稱爲高分子直鏈澱粉分子和低分子直鏈澱粉分子。這種分子結構是現階段本試驗研究的最新發現，特別是目前人們對於低分子直鏈澱粉的分離、結構測定等方面研究還不充分，對於該組分又是如何影響澱粉的結構和降解特徵的研究也有待於更深一步進行。
2.1.2原澱粉(未蒸煮)在發酵過程中澱粉分子色譜圖的變化
對於普通玉米澱粉而言，在發酵過程的前半段(即從0~12h)，直鏈澱粉和支鏈澱粉比例似乎變化不大。這可能說明微生物同時利用直鏈澱粉和支鏈澱粉2個組份，即同時利用澱粉顆粒的結晶區和無定形區。而隨着發酵過程的進一步進行，直鏈澱粉表現出較強的易降解性，這個結果可能提供兩個方面資訊：
一是直鏈澱粉在澱粉顆粒中的分佈狀況;二是隨着發酵的進行，微生物產生了大量的分解酶，酶對澱粉表面及內部侵蝕，這就爲發酵的後半階段(12~24h)微生物有效利用非結晶區提供了前提。這也就是爲什麼在發酵的前半段澱粉顆粒中支鏈澱粉和直鏈澱粉的比例變化不大，而在發酵的後半段直鏈澱粉則被快速地利用。
而對於高直鏈玉米澱粉的發酵，則呈現出極其特異的現象。從色譜圖(圖1b)所呈現出的變化來看，高直鏈澱粉分子在發酵的前半段就呈現出了極強的被利用狀況，相反低分子的直鏈澱粉則表現出了與支鏈澱粉相類似的低發酵特性。這一點爲重新認識澱粉的結構特徵特別是對新型澱粉品種提供了非常有用的資訊。衆所周知直鏈澱粉是形成非結晶區的主要成分，其被降解酶快速有效的利用已經達成共識。而低分子直鏈澱粉的存在以及其對澱粉顆粒結構的影響可能使人們對澱粉的結構有重新認識，也就是說低分子直鏈澱粉在澱粉顆粒中的分佈狀態、分子排列情況等性質都需要做深入的研究。
2.1.3蒸煮後澱粉在發酵過程中澱粉分子色譜圖的變化
蒸煮過程不僅可以破壞澱粉顆粒表面的形貌，還破壞澱粉顆粒的`內部結構，主要體現在兩個方面：一是澱粉內部的結晶區被破壞，支鏈澱粉的分枝雙螺旋的有序排列被打亂，在水溶液狀態中形成大分子的纏繞狀態;另一個變化是無定形區中直鏈澱粉的重排，直鏈澱粉在回升過程中形成更爲有序的排布狀態，這種變化會在其被微生物的利用過程中體現出來。對於普通玉米澱粉，被打亂有序排列結構的支鏈澱粉表現出被快速利用的現象，圖譜(圖1c)顯示24h發酵後基本上未檢測出支鏈澱粉分子，這說明大分子的支鏈澱粉即使發生了在回升過程中的分子重排，但仍快速地被微生物利用。其圖譜中所檢測出的小分子物質可能是由高分子直鏈澱粉被微生物利用後所產生的低分子直鏈澱粉。而對於蒸煮後的高直鏈玉米澱粉而言，除了高分子直鏈澱粉所呈現出的高被利用狀況外，與普通玉米澱粉一樣，其所含的少量的支鏈澱粉也被微生物消化利用，而低分子直鏈澱粉分子則呈現出在發酵後殘留澱粉顆粒中相對積累現象。這說明蒸煮過程中相對於高分子直鏈澱粉分子，低分子直鏈澱粉更易趨於排列成更爲有序的狀態，從而體現出了其慢速發酵性。【圖.略】
2.2發酵過程中澱粉顆粒形態變化
2.2.1原澱粉顆粒在發酵過程中的形態變化
透過SEM可以很清楚的顯示澱粉顆粒被微生物利用的過程。由圖2可見2種原澱粉顆粒發酵過程中形態的變化大不相同。對於普通玉米澱粉而言，微生物的利用是從表面和內部同時進行的，這說明這種澱粉的內部結構比較疏鬆。也有些報道稱這種澱粉表面及其內部有多孔的通道，在微生物發酵過程中可分泌多種酶系，在澱粉酶系作用下澱粉顆粒表面變得粗糙且多孔，這就爲微生物在其表面吸附和進入內部提供條件。這也爲微生物進一步發酵提供新的起點，即在前面所述的微生物及其分泌的降解酶特別是澱粉酶系在此階段開始快速利用澱粉顆粒中的無定形區，這和本試驗的排阻液相色譜所顯示在發酵的後期(12~24h)直鏈澱粉分子被快速利用的結構相吻合。
而對於高直鏈玉米澱粉而言，其微生物的利用途徑則完全不同。電鏡圖(圖2b)顯示澱粉顆粒被微生物利用的過程是逐步由表面向內擴散，這種利用方式可使澱粉顆粒的尺寸逐步變小，這種降解方式可能與其比較緊密的表面和內部結構有關聯，同時這種利用模式和用澱粉酶系測試結果相類似(結果將在近期發表)。因爲高直鏈玉米澱粉中絕大部分是由直鏈澱粉所組成的，由本試驗色譜圖(圖2b)結果可知，高分子直鏈澱粉是逐步被降解消化的，結合相對應的SEM圖可能說明高分子直鏈澱粉主要是排布在澱粉顆粒的表面。但是各類澱粉分子是如何精確地分佈在澱粉顆粒中仍要進一步的研究。
2.2.2蒸煮後的澱粉顆粒在發酵過程中的形態變化
蒸煮導致澱粉顆粒的破碎，在發酵過程中對於普通玉米澱粉而言，在發酵前期形成片狀骨架結構(圖3a)。這可能是由於蒸煮過程中發生了澱粉分子的遷移以及相分離，也就是說容易被微生物所利用的澱粉分子凝聚集中於某些區域，從而被微生物降解後所剩餘的澱粉形成了特定的形態，發酵後期微生物進一步利用殘留骨架，最後形成不規則的形態。
而對於高直鏈玉米澱粉而言，在發酵前期不形成這種骨架結構，但是其表面呈圓滑形態(圖3b)。這可能是因爲其結構緊實，微生物及其產生的酶系由表面逐步利用這類澱粉，從發酵初期到發酵結束似乎均始終以此種由表及裏的發酵模型進行。
3結論
採用複合微生物發酵方法來研究澱粉的精細結構，這有區別於傳統的單酶或雙酶作用體系來研究澱粉的結構，前者具有獨到之處，這是因爲澱粉顆粒雖然絕大部分是澱粉，但它仍存在少部分的脂肪、蛋白質、非澱粉質多糖與其它雜質，這些雜質的存在也會對澱粉的降解產生外部因素的影響。
本試驗非常有效地揭示出不同澱粉分子發酵的動力學，其中已經證實高分子直鏈澱粉分子(無論存在於普通玉米澱粉還是存在於高直鏈玉米澱粉)容易被微生物所利用。排阻液相色譜結果顯示高直鏈玉米澱粉中的低分子直鏈澱粉分子具有很強的抗降解性，這就爲研究澱粉中各種澱粉分子在澱粉顆粒中的排布情況提供了有價值的資訊。
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