課題名稱 HPLC法測定伏立諾他有關物質和含量的研究
[研究的主要目的和意義]
vorinostat (商品名Zolinza) 是Merck 公司開發的世界上第一個抑制組蛋白脫乙酰基酶( his2tone deacetylase ,HDAC) 的新型抗癌藥物,該藥於2006 年10 月6 日獲得美國FDA 批准上市,用於其他藥物治療時或治療後仍不能治癒、或惡化、或病情反覆情況下的轉移性面板T 淋巴細胞瘤。vorinostat 化學名: N-羥基-N苯基辛二酰胺;英文名: N-hydroxy-N-phenyloctane-diamide
vorinostat 屬於組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗腫瘤藥物,低濃度( IC50 < 86 nmol·L - 1) 即可以有效抑制組蛋白脫乙酰酶HDAC1 、HDAC2 、HDAC3 和HDAC6 的活性,抑制組蛋白次乙酰化,因而從基因水平調控細胞週期,阻斷癌細胞基因複製,並激活其凋亡基因,達到抑制和殺滅癌細胞的效果。但vorinostat 的抗癌機制仍在深入研究之中,其具體作用機制尚不完全清楚[6 - 7 ] 。兩項臨牀試驗證明了vorinostat 的安全性和有效性,其中包括107 名接受其他藥物治療後又復發的CTCL 患者。按面板損傷改善標準評分等級的判斷,接受Zolinza 治療的患者中30 %有所改善,療效平均持續168 d。
一些生物學數據已經證明了vorinostat 在面板癌，前列腺癌治療中的有效性。而且近年研究vorinostat 不僅可以單獨作爲腫瘤治療藥物,還可以與其它抗癌藥物聯合用藥, 減少對正常細胞的毒性,具有增效作用。可與轉錄調節因子(如52 雜氮22′2 脫氧胞苷、視黃酸、mRNA 轉錄抑制劑flavopiridol)[51- 53] 、凋亡受體配體(如阿黴素、長春新鹼、依託泊苷、多烯紫杉醇)[54- 56]、化療藥物(如抗代謝藥吉西他賓、全反式維甲酸) [57,58]以及激酶抑制劑、放射線等聯合用藥。近年來研究發現vorinostat
還可影響到有絲分裂、DNA 複製和修復以及調控非組蛋白的蛋白質乙酰化程度。但是該藥用於臨牀治療癌症仍然需要解決一些問題如: 抑制劑對HDAC 酶系的選擇識別作用、選擇最佳藥用劑量、治療週期以及尋找更多可以促進這種藥抑制作用的物質等。毋庸置疑,隨着對HDACIs 抗癌機理的深入研究,vorinostat 將會有廣闊的應用前景。
伏諾立他目前在國內還沒有上市，我們準備仿製該品種，建立該藥的質量標準，用建立的標準對原料和製劑進行有關物質和主藥含量進行研究。
[採用的研究手段及文獻綜述]
根據破壞試驗的結果，結合伏立諾他合成工藝，建立伏立諾他有關物質檢查方法，並對其進行方法學驗證。
1.儀器與藥品
Waters 996光電二極管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站，試藥及其中間體均由南京海納醫藥科技公司提供
2. 色譜條件的建立
2.1檢測波長的選擇
取伏立諾他適量,用流動相製成每1ml含15μg的溶液,照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄Ⅳ A)在200～400 nm波長範圍內掃描測定
2.2系統使用性試驗
色譜柱:Diamonsil C18 ( 250 mm ×4. 6 mm, 5μm)色譜柱爲分析柱;乙腈- 0.1%磷酸溶液(三乙胺調PH3.0)爲流動相，不斷調節流動相比例，梯度洗脫，流速爲1.0 ml ·min- 1 , 檢測波長爲241nm, 柱溫30℃, 進樣量: 20μl。
根據合成工藝,伏諾立他成藥中可能引入一系列的合成中間體及原料還有雜質，取本品可能帶入的雜質、中間體分別加流動相適量溶解;另取雜質中間體及伏立諾他適量,用流動相製成適宜濃度的溶液,精密
吸取雜質，中間體與吡非尼酮混合溶液各20 μl,分別進樣，考察分離度，理論塔板數，及拖尾因子，再根據具體條件進行調整，選出最適合的`條件。
2.3專屬性試驗
取供試品,進行高溫、光照、酸、鹼、氧化破壞試驗。
熱降解溶液的配製:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,置140℃高溫4 h後,用流動相溶解並稀釋至刻度; 光降解溶液的配製:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,用流動相製成每1 ml含吡非尼酮0. 8 mg的溶液,置紫外燈光下48 h;
酸降解溶液的配製:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1鹽酸溶液5 ml,放置4 h,用2 mol·L - 1氫氧化鈉溶液調至中性,加流動相稀釋定容;
鹼降解溶液的配製:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1氫氧化鈉溶液放置4 h,溶液顏色變黃,另加2 mol·L - 1鹽酸溶液調至中性,加流動相稀釋定容;
氧化破壞溶液的配製:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加過氧化氫5 ml,避光放置4 h,用流動相稀釋定容。照高效液相色譜法,取上述各溶液各20μl進樣,記錄結果，進行分析
2.4線性範圍：
精密稱取伏立諾他對照品約15 mg,置50ml量瓶中,加流動相溶解並稀釋至刻度,搖勻,作爲貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4、5 ml置10 ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。分別取溶液20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖,量取峯面積,由溶液濃度(C) 對峯面積(A)線性迴歸。
2.5檢測限：取空白基線一段,計算其噪音峯高,再將伏立諾他樣品溶液用流動相稀釋適當濃度進樣,使其峯高爲噪音峯高的3倍,記錄檢測限。
2.6精密度試驗
2.6.1 進樣精密度：取標準曲線項下高、中、低三種濃度的溶液,分別重複進樣5 次,以峯面積來考察精密度。
2.6.2中間精密度：選擇不同人員,分別測定同一批樣品的含量。
2.7重複性試驗：分別取同一批樣品, 6份,精密稱定,照樣品測定項下操作,計算含量。
2.8穩定性試驗：照標準曲線項下的方法配製高、中、低三種濃度 的溶液,分別於0、1、2、4、6、8 h測定。考察其穩定性
2.9含量測定：取本品適量,精密稱定,用流動相製成每1ml含50μg的溶液,作爲供試品溶液,精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峯面積;另取經乾燥至恆重的伏立諾他對照品適量,同法測定,按外標法以峯面積計算,即得。
2.10有關物質測定：取本品適量,精密稱定,用流動相製成每1 ml含0.5mg的溶液,作爲供試品溶液;精密量取供試品溶液1 ml,置100 ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作爲對照溶液。精密量取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調節檢測靈敏度,使主成分色譜峯的峯高爲滿量程的10% ～25%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峯保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峯,最大單個雜質峯面積不得大於對照溶液主峯面積的1 /2 ( 0.5% ) ,各雜質峯面積總和,不得大於對照溶液主峯面積( 1% )。
參考文獻：
【1】胡 楊，陳國華，吳 燕，楊尚彥.伏諾立他的合成[J].中國醫藥工業雜誌，2009，40(7)：481-482.
【2】黃小平，徐江. 組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗癌藥Vorinostat[J].化工中間體，2009，06：11-13.
【3】Sakajiri S, Kumagai T, Kawamata N, et al. Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines [J]. Exp Hematol, 2005,33(1): 53-61.
【4】Robert se, Julianne eran, Jan era, Suresh Ramalingama, Merrill J. Egorin. A liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometric assay for quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat (suberoylanilide hydroxamicacid, SAHA),and its metabolites in human serum[J]. Chromatography B, 840 (2006) 108