摘要：爲提高黑麴黴(Aspergillusniger)A24誘變菌株產菊粉酶的活力，採用單因子試驗方法對該菌株的最佳產酶條件進行了優化。結果表明：該菌株在以3%菊芋汁爲碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4爲複合氮源的培養基中，初始 pH值6.0，30℃培養72h的條件下，所得的發酵液中酶活力最高，達到35.21U/mL，比優化前提高了18%，表明該菌株有一定的應用潛力。
關鍵詞：黑麴黴;菊粉酶;酶活力;發酵條件;優化
傳統果糖的生產一般是由澱粉透過葡萄糖的異構化取得，該法工藝複雜、成本較高、果糖含量低。因此，人們一直在尋求一種廉價的新糖源和生產果糖的方法。其中菊粉酶(Inulinase或Inulase)主要催化水解菊粉中的β-2，1呋喃果糖苷鍵，由於能在溫和條件下水解菊粉產生果糖(70%以上)和少量葡萄糖，只需一步酶解過程，工藝簡單，生產成本低，可直接製備超高果葡糖漿，已成爲果糖工業化生產的主要酶製劑，爲低聚果糖的生產提供了一個很好的解決辦法。但來源於植物的菊粉酶底物專一性較強，僅作用於菊粉;由微生物產生的菊粉酶大都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷鍵的多種糖類，如菊糖、蔗糖和棉子糖等[1]。其中黴菌具有所產菊粉酶的最適溫度較高、熱穩定性好、適宜偏酸性的環境等特點而倍受關注。由濰坊學院生命科學學院實驗室所儲存的黑麴黴(Aspergillusniger)A24誘變菌株是從菊芋根際周圍土壤中篩選出的一株產菊粉酶、又經過多輪紫外線誘變獲得的菊粉酶產量較高的菌株。該試驗在此基礎上，對其發酵條件進一步優化，以期獲得更高的產菊粉酶活力，爲進一步研究菊粉酶的生產以及生產應用提供理論基矗
1、材料與方法
1.1供試材料
黑麴黴(Aspergillusniger)A24誘變菌株，由濰坊學院生命科學學院實驗室儲存。菊芋(HelianthustuberosusL.)採自濰坊市郊區。菊芋汁參照前人研究方法進行製備[2]。
1.2發酵培養條件及發酵液的製備
取0.1mL黑麴黴孢子懸液，接入50mL的YJ(初始培養條件：菊粉2%，酵母膏0.3%，(NH4)2HPO41%，初始pH值6.0)發酵培養液中(250mL三角瓶)，在不同條件下進行發酵培養。
1.2.1不同碳源對產菊粉酶的影響。選擇碳源分別爲2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，將黑麴黴A24誘變菌種接入到不同碳源的培養基中，調節各培養基初始pH值爲6.0，在30℃、120r/min的條件下培養72h，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min後，收集上清液，分別測定酶活力。並選擇出最優碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同濃度的該最優碳源對產菊粉酶的活力影響。
1.2.2不同氮源對產菊粉酶的影響。用3%的菊芋汁作碳源，以不同種類的複合氮源(有機和無機)製備的培養基發酵培養3d後，測定其發酵液中菊粉酶活力，確定最佳有機氮源;在確定最佳有機氮源爲牛肉膏、無機氮源爲(NH4)2HPO4的基礎上，進行有機氮源和無機氮源最佳配比試驗。以牛肉膏和(NH4)2HPO4做複合氮源發酵試驗，取質量濃度分別爲1%、2%、3%的'牛肉膏和質量濃度分別爲0.3%、0.5%、0.8%的(NH4)2HPO4進行復合。調培養基初始pH值爲6.0，於30℃，發酵培養3d，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min後，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.3培養基初始pH值對產菊粉酶的影響。設培養基初始pH值分別爲3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、(CNH4)2HPO4爲複合氮源，於30℃條件進行發酵培養3d。將各處理的發酵液經8000r/min離心10min後，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.4發酵溫度對產菊粉酶的影響。以3%菊芋汁爲碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4爲複合氮源、初始pH值6.0的發酵培養基，對黑麴黴A24誘變菌株分別在24、26、28、30、32℃下進行發酵培養72h，將各處理的發酵液經8000r/min離心10min後，收集上清液，分別測定酶活力。
1.2.5發酵時間對產菊粉酶的影響。以3%菊芋汁爲碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4爲複合氮源，培養基初始pH值爲 6.0，30℃下分別發酵24、48、72、96、120h，每隔24h取樣。將各處理的發酵液經8000r/min離心10min後，收集上清液，測定酶活力。
1.3發酵液中還原糖含量及菊粉酶的活力測定
採用3，5-二硝基水楊酸法測定發酵液中還原糖的含量，在540nm波長處測定吸光度值，根據葡萄糖的標準曲線，求得還原糖的含量;酶活力定義爲在規定反應條件下每分鐘轉化底物生成1μmol還原糖所需的酶量爲一個酶活單位(U/mL)，按照Pessoni等人報道的研究方法測定菊粉酶活力 。
2、結果與分析
2.1不同碳源對產菊粉酶的影響
試驗結果表明，以2%菊芋汁爲碳源時酶活力最高，爲12.33U/mL;菊粉次之，爲10.18U/mL;葡萄糖、果糖爲碳源時酶活力較低，均在 2.5U/mL以下。進一步分析不同濃度菊芋汁爲碳源對產菊粉酶的影響，發現菊芋汁濃度爲3%時，菊粉酶活力最高，爲11.18U/mL。
2.2不同氮源對產菊粉酶的影響
研究結果表明，複雜有機氮源比簡單無機氮源有利於菊粉酶的產生，且最適有機氮源爲牛肉膏，無機氮源爲(NH4)2HPO4，2種氮源所得到的菊粉酶活力分別爲14.14、8.64U/mL。由表1可以看出，複合氮源比單純有機或無機氮源更有利於菊粉酶的產生，且當牛肉膏和(NH4)2HPO4的質量濃度分別爲2%和0.5%時，菊粉酶活力最高，爲19.98U/mL。
2.3培養基初始pH值對產菊粉酶的影響
檢測不同初始pH值對黑麴黴A24誘變菌株產菊粉酶的影響，結果如圖1所示。可以看出，在初始pH值爲3~6的範圍內，隨着pH值升高，菊粉酶酶活增強，pH值爲6.0時產菊粉酶酶活最高，達到28.83U/mL。此後隨着pH值升高，菊粉酶酶活明顯下降。
2.4發酵溫度對產菊粉酶的影響
試驗結果表明，在24~30℃範圍內，隨着培養溫度升高菊粉酶酶活增強，30℃時產菊粉酶酶活最高，爲32.51U/mL。此後，隨着溫度升高，菊粉酶酶活明顯下降，說明菊粉酶對溫度比較敏感。因此，30℃是黑麴黴A24誘變菌株產菊粉酶的最適溫度(圖2)。
2.5發酵時間對產菊粉酶的影響
可以看出，隨發酵時間的增加，黑麴黴A24誘變菌株產菊粉酶活力增強，在培養72h後產菊粉酶酶活最高，爲35.21U/mL。此後，隨着發酵時間延長，菊粉酶酶活有下降趨勢。