蛋白工程是指透過改變已知蛋白的結構來改變其性質的過程，需要藉助計算機和生物資訊學手段來實現，是研究酶的功能及進化的重要技術，下面是小編蒐集整理的一篇探究轉氨酶在手性化合物合成現狀的論文範文，歡迎閱讀檢視。
前言
近年來，手性製藥工業迅速發展壯大，單一對應體藥物每年以大於20%的速度增長，其對手性胺的需求也隨之增長。目前，超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作爲中間體，抗糖尿病新藥Janu-via的主要成分西他列汀是R-型胺。這就催促人們尋找一種高效製備手性胺的方法，而轉氨酶的出現使研究者看到了曙光。轉氨酶以其高選擇性、高轉化率及溫和的反應條件贏得了廣大研究者的青睞，其能夠催化1個氨基供體(氨基酸或簡單的胺)上的氨基轉移到前手性的受體酮，得到手性胺和副產物酮或者α-酮酸(圖1)，反應過程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)的參與。
轉氨酶合成手性化合物已經發展爲一項關鍵的不對稱合成技術，受到越來越受到衆多研究者的重視和關注。2013年2月28日，第一屆國際轉氨酶生物催化研討會於瑞典斯德哥爾摩召開，鑑於此，本文作者將轉氨酶在手性化合物合成中涉及到的蛋白工程、表達與固定化、進程工程及應用方面的研究現狀予以綜述。
1轉氨酶蛋白工程
蛋白工程是指透過改變已知蛋白的結構來改變其性質的過程，需要藉助計算機和生物資訊學手段來實現，是研究酶的功能及進化的重要技術，也是改變酶性質、開發新酶的重要方法。利用蛋白工程的方法對轉氨酶進行改造即爲轉氨酶蛋白工程，其目的是得到有工業應用價值的酶，打通手性藥物及化工產品的酶法合成途徑。所用關鍵技術包括理性設計、定向進化以及兩者組合方法;所涉及工具主要包括迭代飽和誘變(it-erativesaturationmutagenesis，ISM)、組合活性位點飽和測試(combinationofactivesitesaturationtest，CASTing)、蛋白序列活性關係(proteinse-quenceactivityrelationship，ProSAR)等。隨着計算機技術以及生物資訊學的快速發展，轉氨酶蛋白工程迎來了第三次浪潮，成爲國內外研究熱點。
轉氨酶蛋白工程主要包括5個步驟:選擇合適的模板、穩定模板、確定活性位點、活性位點周圍氨基酸殘基理性設計或定向進化、突變體活性評估。經過以上幾步，就可以根據人們的意願將一個原本對某一底物無活性的轉氨酶變爲對此底物活性很高的生物催化劑，在此方面最成功的例子當屬Savile等利用蛋白工程手段得到的突變型ATA-117，其能夠用於工業化生產西他列汀。到目前爲止，此酶是轉氨酶工業化應用最成功的例子，利用該酶的西他列汀生物催化合成工藝獲得2010年美國總統綠色化學挑戰獎。目前，國內外很多課題組都在進行轉氨酶蛋白工程的研究，近五年來，新型轉氨酶如雨後春筍般涌出(表1)。
2轉氨酶表達與固定化
轉氨酶的表達目前有3種途徑。第一，利用原始菌株表達，由於原始菌株表達量低及效率低下等不足，此途徑現一般只在新產酶菌株初步篩選階段使用;第二，利用工程菌表達，此法應用最多，目前轉氨酶已經在原核與真核系統中實現表達。原核表達普遍採用大腸桿菌表達系統，例如Iwasaki等成功構建一種R-型轉氨酶(R-TA)的表達工程菌E.coliHB101-pAT28-R-TA，透過工程菌的誘導表達可以得到大量R-TA;Savile等構建工程菌E.coliW3110-pCK110700-ATA-117表達ATA-117及突變酶;Cassimjee等利用工程菌E.coliBL21(DE)-pET28-ATA-113成功實現轉氨酶ATA-113的大量表達。原核表達系統是目前掌握最爲成熟的表達系統，其優點在於能夠在較短時間內獲得基因表達產物，而所需的成本相對低廉。但原核表達系統還存在許多難以克服的缺點，如無法對錶達時間及表達水平進行調控，目的蛋白易形成包涵體，導致產物純化困難。爲彌補以上不足，許多學者將原核基因調控系統引入真核基因調控領域，採用真核系統進行目標蛋白的表達。真核表達有酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統和哺乳動物細胞三種系統，目前，轉氨酶多采用畢赤酵母表達系統，如Bea等成功構建了ω-TA的真核表達系統P.pastorisGS115-pPIC-ω-TA;Weinhandl等透過轉氨酶基因密碼子優化，構建了能夠大量表達ilvE的P.pastorisMut-SpPpT4_S/pPpT4_GAP_S-ilvE。真核表達系統能誘導基因高效表達，可達原始表達量的105倍，另外，其還能嚴格調控基因表達，是原核表達系統所不能及的，因此，利用真核表達系統來表達目的蛋白越來越受到重視，其多用於可調控的轉氨酶的大量表達。第三，透過無細胞體系表達。Kwon等建立了一種無細胞蛋白合成系統成功實現了ω-TA的非克隆性表達，此方法主要使用於轉氨酶的高通量篩選。
在轉化中作者通常用到2種酶形式:遊離酶和固定化酶。遊離酶活性雖高但是隻能用1次，且會影響產物的分離純化，而固定化酶則會大大提高重複利用率，因此成爲了研究重點。轉氨酶的固定化包括固定化細胞和固定化遊離酶。固定化細胞所用材料主要是殼聚糖、海藻酸鈉以及一種新型材料LentiKats。Rehn等發現利用殼聚糖固定化含有ω-TA的大腸桿菌細胞，在優化條件下，細胞加載量可達3.2g·g-1殼聚糖，殘留活性大於60%，在1h的反應中，連續8次反應，固定化酶活性仍大於90%。Fernandez等利用LentiKats固定化含有ω-TA的大腸桿菌細胞，其穩定性得到了提高，在連續五次合成1-苯乙胺及3-氨基-丁苯後，殘留活性仍大於80%。固定化遊離酶所用材料主要有聚合樹脂、溶膠/硅藻土基質、殼聚糖、硅膠。Truppo等利用一種聚合樹脂SEPABEADEXE120成功固定化西他列汀轉氨酶(突變型ATA-117)，固定化酶以異丙醇爲溶劑，在200g·L-1底物濃度下，重複使用10次，連續反應200h，其活性並無損失。Mallin等利用優化的殼聚糖固定化兩個R-TA，兩個固定化酶對於1-苯乙胺的合成都有很好的活性，其中一種轉氨酶轉化在合成R-2-己胺時，活性比遊離酶提高了13.4倍，轉化率大於99%。此外，Matosevic等利用固定化酶微反應器平臺成功實現了手性氨基醇多步生物轉化篩選過程。由以上例子可以看出，轉氨酶的固定化在提高酶穩定性、拓寬酶使用範圍以及改善酶反應條件方面都有重要意義，透過固定化，有望克服遊離酶反應的過程瓶頸，實現轉氨酶工業化應用。但是固定化酶由於傳質限制，酶活性會普遍降低，同時固定化酶的製備增加了酶的成本，因此更加優越的固定化介質有待開發。
3轉氨酶過程工程
轉氨酶催化的轉氨反應是一個熱力學平衡過程，主要包括兩個互補的反應:手性胺的不對稱合成和外消旋胺的運力學拆分。以上兩個反應過程受反應物、產物、反應條件等因素影響，反應時所發生的平衡逆向移動是轉氨反應中的瓶頸問題。因此，要實現高效率不對稱合成就需要從影響因素入手，改變反應的平衡。衆多學者就此問題進行了深入的研究，現將解決方案歸納如下:
3.1加入過量的氨基供體
改變平衡的一個最簡單的方法就是加入過量的氨基供體，Savile等在生產西他列汀時就採用了此方法:在優化的反應條件下，向40mL反應體系中加入2-丙胺39.8mmol，前西他列汀酮18.9mmol，此時氨基供體的量是氨基受體的2倍;在放大的反應體系中，加入高達10倍過量氨基供體，反應得到西他列汀的轉化率爲92%。
需要注意的是此種方法只適用於反應的平衡對產物產率影響不大的情況。如果平衡嚴重不利於產物的生成，而反應所需的底物質量濃度比較高(>50g·L-1)，氨基供體和受體按照1～50∶1的摩爾比進行反應，氨基供體的過量倍數將會受到限制，加入太多的氨基供體將會出現可溶性差等其他的問題。
3.2副產物的自動降解
副產物自動降解是利用副產物在反應條件下自動形成另外一種非反應成分，達到解決抑制的目的。Lo等發現以鳥氨酸和賴氨酸作爲氨基供體時，反應產生的氨基酮會自動環化，使平衡向生成胺的方向移動。同樣Truppo等在利用轉氨酶合成6-甲基-2-吡咯酮(50g·L-1)的反應中(圖2)，利用一級產物乙胺基丁酰乙酯的自動環化，形成非抑制性終產物6-甲基-2-吡咯酮的反應趨勢，解除一級產物抑制，獲得終產物時轉化率大於90%，產物ee值大於99%。副產物自動降解是一種非常傳統的方法，受到副產物性質限制，其應用並不多。
3.3移除產物或副產物
由於產物或副產物的存在，常常會對平衡產生抑制作用，因此可以透過在反應時移除產物或者副產物的方法來改變平衡，這種方法也稱爲在位產物移除(insituproductremoval，ISPR)，ISPR的效率與產物胺以及其它反應組分的性質有關。
其中產物的物理化學性質如揮發性、溶解性、帶電性、疏水性、和分子大小是ISRP中研究最多的幾個方面。
實現ISPR的途徑有多種。Koszeiewski等在利用ATA-117轉化4-苯基-2-丁酮合成R-4-苯基丁-2-胺的過程中，綜合運用有機溶劑萃取和調整pH的方法使反應物的轉化率達到92%，ee值高達99%;Truppo等在利用ATA-113和ATA-117轉化苯乙酮合成α-甲基苯乙胺的過程中採用樹脂提取技術成功獲得了高達99%的轉化率，與之前不採用ISPR技術的轉化率10%相比，反應的轉化率得到了大幅度的提高。另外讓易揮發的副產物揮發掉也可以作爲改變平衡的一個方法。
當以2-丙胺或者2-丁胺作爲氨基供體時，會產生副產物丙酮或者丁酮，由於丙酮和丁酮與其它反應物相比具有較低的沸點，因此可以透過減壓使副產物揮發掉，這樣轉氨反應就趨於完全。此外對於易揮發的胺還可以透過蒸餾的方法進行產物回收，這種方法多用於動力學拆分。
3.4酶偶聯反應
酶偶聯反應是指將轉氨反應與其它酶促反應聯合使用，將副產物(丙酮酸或者丙酮)轉化爲非反應成分或者原始的底物。此方法是到目前爲止研究和應用最多的提高不對稱合成產率的途徑，表2對常用的酶級聯反應進行了總結。Cassimjee等用來自A.citreus的具有S-選擇性的ω-轉氨酶作爲催化劑，以異丙胺爲氨基供體，在催化苯乙酮合成S-1-苯乙胺的反應(圖3)中引入平衡置換系統:YADH/FDH(yeastalcoholdehydrogenase/formatedehydrogenase)，其中YADH將生成的丙酮轉化爲2-羥基丙醇，FDH再生輔因子NADH(nicotinamideadeninedinucleotideplushydro-gen)，驅動反應正向進行，成功獲得高達99%的產率和99.9%的ee(enantiomericexcessvalue)值，未引入平衡置換系統的反應轉化率只有60%～80%。Schatzle等利用七種R-型轉氨酶合成R-胺時，引入LDH/GDH(lactatedehydro-genase/glucosedehydrogenase)系統，透過優化反應條件，使得產物產率高達99%。其中LDH將丙酮酸轉化爲2-羥基丙酮酸，GDH用來再生輔因子NADH，轉氨酶聯合LDH/GDH達到了高效合成手性胺的目的，此外在以上兩個反應體系中，由於使用輔因子再生系統，在一定程度上降低了反應的經濟成本。Truppo等在轉氨酶ATA-117拆分外消旋苯乙胺的反應體系中加入D-氨基酸氧化酶，實現了丙酮酸再生，同時反應的平衡也發生了移動，反應1h，轉化率可達到50%，(S)-1-苯乙胺ee值高於90%，而之前反應1h轉化率只有7.5%，產物ee值只有8%。由此可見利用酶偶聯反應可以大大提高不對稱合成以及動力學拆分的產率，對於小規模製備來說是一種高效可行的方法。
合理的酶反應系統是獲得高轉化率的保證。酶的性質、反應體系中各成分的相互作用、輔因子的加入量等都會影響反應效率，比如在FDH體系中加入高濃度的甲酸鹽會影響其它酶的活性和穩定性。Santacoloma等對酶級聯反應相關問題做了詳細的討論。酶級聯反應的效率雖然很高但是其經濟成本很高，不適合大規模製備。一個替代途徑就是用全細胞作爲催化劑。利用生物技術的方法實現目標酶在宿主菌中共表達，利用全細胞進行催化。Yun等利用可以共表達ω-TA和乙酰乳酸合成酶的Ecoli全細胞作爲催化劑，成功合成了S-α-甲基苯胺，Bea等利用含有ω-TA和內源性氧化還原酶的重組畢赤酵母爲催化劑，成功拆分α-苯乙胺，ee>99%，轉化率達52.2%。此外，Wang等開發了一種新的單酶級聯反應體系，用ω-TA催化高效不對稱合成手性胺，克服了多酶級聯反應的成本高、酶不相容等缺點，但是此方法目前並不能用於手性胺的大量生產。
4轉氨酶應用
轉氨酶主要用於手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇等的合成，這些手性化合物在製藥工業、農業、化工業都有重要的作用，其常作爲藥品的活性成分或主要中間體被使用。目前，立體選擇性的合成以上手性化合物主要是透過化學法實現，如大家熟知的不對稱還原Stiff鹼，但是化學法存在一些不足，如反應條件苛刻、運用有毒的過渡態金屬催化劑等，有時候在單一的催化反應中得不到足夠的立體選擇性，引起了一系列的環境問題，產品也不符合藥物要求。然而利用轉氨酶催化製備相應的手性化合物反應條件溫和、過程簡單、立體選擇性高，逐漸取代了一些化學步驟。利用酶法、化學-酶法合成含手性胺的活性藥物以及小分子手性胺非常具有發展前景。下面從四個方面介紹轉氨酶在合成手性化合物中的應用。
4.1合成手性胺
手性胺是合成許多手性藥物的重要中間體，也是含氨基的光學純藥物的主要成分。神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等都是以手性胺作爲中間體;而抗糖尿病新藥Januvia的主要成分西他列汀是R-型丁二胺。
在手性胺的合成中兩者同樣重要。下面逐一介紹。
a.不對稱合成，是指在合適的氨基供體(如異丙胺，L-丙氨酸)存在下，轉氨酶催化前手性酮生成相應的手性胺的過程。其又可細分爲兩類，酶一步合成法和化學-酶合成法。例如，Savile等利用突變型R-轉氨酶ATA-117不對稱合成西他列汀，經過一步反應，成功得到西他列汀，實現了西他列汀200g·L-1的工業化生產，24h轉化率>95%，ee>99.5%(圖4);Fuchs等成功採用化學酶法全合成得到(S)-利斯的明，其首先利用ω轉氨酶合成所需的前體1-苯乙胺，並利用酶偶聯反應解決平衡移動問題，後利用化學法合成其餘基團(圖5)，經過四步反應，整體收率達71%，ee>99%。以上例子的成功都是非常激動人心的，但由於反應的可逆性，其轉化率理論不能達到100%，因此，解決平衡移動問題仍然是今後需要深入研究的。
b.動力學拆分，是指在合適的氨基受體(如苯乙酮)存在下，轉氨酶催化外消旋胺生成光學純手性胺的過程。其實質也是轉氨反應，只是在本反應中氨基供體爲外消旋胺中一個構型的胺，轉氨酶將一個構型的氨基轉移至氨基受體上，得到與轉氨酶選擇性相反的光學純的胺。理論上，轉化率>50%所得產物的ee>99%，拆分效果較好。例如，Koszelewski等利用R和S-2種轉氨酶組成一鍋兩步法用於美西律的去消旋化，成功獲得了光學純的美西律，其收率達97%，ee>99%，這也是拆分和不對稱合成相結合比較成功的例子(圖6)。動力學拆分能夠成功得到高光學純的產物，同時引入了底物酮，若採用Koszelewski所述的方法將能成功變廢爲寶，達到雙贏的.目的。
c.工業應用情況:一個生物催化劑要應用到工業生產中，其底物質量濃度至少應達到50g·L-1，因此大部分轉氨酶，由於底物濃度、反應溫度、有機溶劑耐受性等衆多因素的限制目前只停留在實驗室階段。近幾年轉氨酶在工業應用最成功的例子當屬突變型ATA-117，其能夠用於西他列汀的工業生產。除此外，其他小分子胺的生產也達到了工業要求，如Truppo等採用轉氨酶與LDH偶聯以及離子交換樹脂在位移除產物兩種方法，成功實現了R/S甲基苯乙胺以及R/S6-甲基-2-哌啶酮50g·L-1的高效生產，其收率>90，ee>99%。表3對近幾年利用轉氨酶生產手性胺的情況進行了歸納總結，由此可見轉氨酶在製備手性胺方面具有較大的應用潛力和開發價值，是目前及未來的研究熱點。
4.2合成手性氨基酸
光學純的氨基酸在生物體內起着舉足輕重的作用，同時在製藥工業有着重要的作用。很多α-和β-氨基酸及其衍生物是生物體內關鍵的神經遞質，如穀氨酸鹽、γ-氨基丁酸;而很多非蛋白氨基酸則在生物次級代謝過程中有重要作用，圖7對含氨基酸的藥物進行了總結。2008年之前，開發有藥學活性的光學純氨基酸吸引了衆多藥學家的眼球，利用轉氨酶製備芳香族β-氨基酸、L-α-氨基酸，脂肪族L-α-氨基酸以及D-氨基酸、15N標記的氨基酸等層出不窮，Hohne等對此進行了綜述。
到目前爲止，生物催化法制備手性氨基酸最成功的例子爲L-高苯丙氨酸的製備。L-高苯丙氨酸是製備血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑藥物的重要原料，它是目前世界上約20種抗高血壓新藥的共同中間體，如依拉普利、地拉普利、西拉普利等。目前用於製備手性氨基酸的轉氨酶種類很多如酪氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、ω-轉氨酶等。Lo等用工程化的大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶高效製備了L-高苯丙氨酸。Min等用固定化的消旋酶及氨甲酰水解酶由相應底物製備L-高苯丙氨酸，此固定化酶可重複利用14次，實現了轉氨酶的重複高效利用，更有利於工業化應用。
4.3合成手性氨基醇
手性氨基醇結構中含有手性氨和手性醇，是一類更有價值的生化試劑及藥物中間體，如抗病毒糖苷酶抑制劑、鞘脂類藥物，廣譜抗生素氯黴素、甲碸黴素等衆多藥物中均含有手性氨基醇。目前生產手性氨基醇的方法有化學法和生物催化法2種，相對於化學法，生物催化法更加綠色、高效，因此便成爲研究熱點。
生物催化法制備手性氨基醇主要由有3種途徑:a.酮還原酶或轉酮醇酶與轉氨酶偶聯，轉化底物酮生成手性氨基醇;b.轉氨酶轉化手性酮醇爲手性氨基醇;c.酮還原酶轉化手性氨基酮爲手性氨基醇。由此可見，轉氨酶在手性氨基醇的合成中起着舉足輕重的作用，利用轉氨酶製備手性氨基醇也越來越受到化學家的親睞。Smith等設計了一種簡潔的合成手性氨基醇的方法:轉酮醇酶和ω-轉氨酶偶聯，透過兩步反應，成功製得(2S，3S)-2-氨基戊烷-1，3-二醇，此法可以實現(2S，3S)-2-氨基戊烷-1，3-二醇製備規模的生產。
Smithies等利用C.violaceumω-轉氨酶成功將1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮轉化爲(2S)-2-氨基-1-苯基-1，3-丙二醇，而此酶對外消旋1，3-二羥基-1-苯丙基-2-酮並無選擇性(圖8)，因此其用於轉化底物酮醇製備手性氨基醇非常理想。雖然以上例子均令人欣喜，但是能夠高效製備手性氨基醇的轉氨酶種類並不多，尤其是能用於工業化生產的更是少，因此，新的酶以及更優的反應條件亟待開發。
4.4合成含氘氚標記的手性胺
放射性氘、氚標記的化合物對於瞭解藥物代謝和藥物動力學有重要作用。氘氚標記的藥物在臨牀前研究中，有利於研究者理解藥物的吸收和分佈，對提高其活性有重要指導意義。傳統方法是從含氘氚標記的底物直接合成手性胺，而Truppo等透過向反應體系中加入氘、氚的方法直接由前手性酮製備得到了多種重氫標記的手性胺，如含氘西他列汀的製備(圖9)。在60%的氘水和40%DMSO溶劑中，經過20h轉化，20g·L-1的底物有82%轉化爲含氘西他列汀，此西他列汀中所有氫均被置換爲氘。利用轉氨酶CDX-017製備氚標記的N-Cbz吡咯胺，在優化的反應條件下，經過2d反應，N-Cbz吡咯胺中氚的富集程度達到280%，明顯高出統計值100%。以上例子說明轉氨酶同樣可以用於催化前手性酮製備多種重氫標記的手性胺，其過程簡單可操作性強，是今後的發展趨勢。
5結語
近年來，轉氨酶在手性化合物合成中得到了廣泛應用，其憑藉綠色、高效的合成優勢吸引了無數化學家的關注，人們採用化學-酶法結合的手段製備得到了大量手性胺。近五年來，從轉氨酶蛋白工程、表達、固定化、進程工程到應用，國內外研究者都投入了大量的精力，也得到了很多可喜的成果。但是目前能夠用於工業化生產的轉氨酶並不多，因此新型酶的篩選以及反應條件的優化仍然是目前利用轉氨酶合成手性化合物面臨的兩大挑戰。開發新酶、改造現有酶以及研究轉氨酶過程工程等工作仍將是研究者們今後的研究重點，作者希望開發出更多可用於工業化生產的轉氨酶，以期搭建起手性胺的生物催化生產平臺。
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