摘要: 目的： 研究如何提高體外培養人牙周膜細胞（hPDL）的成功率，爲簡便、快速地獲得大量成活率高的hPDL膜細胞，建立體外細胞模型提供一定的實驗方法。方法： 利用3種不同方法（組織塊法、酶消化組織塊法、全牙消化法）進行牙周膜細胞的原代培養，用形態學、免疫細胞化學染色等方法鑑定細胞來源；透過生長曲線的測定研究體外細胞生長特性。結果： 3種方法獲得的細胞形態和生物學行爲大致相同；波絲蛋白抗體染色陽性，角蛋白抗體染色陰性。組織塊法培養的細胞同源性好，但初代培養時間長；全牙消化法的原代培養成功率高於其他2種方法。結論： 透過對牙周膜細胞培養方法的改良，可以顯著提高hPDL原代培養的成功率。
關鍵詞: 牙周膜； 細胞培養； 免疫組織化學
細胞體外分離培養是研究複雜的生物系統的重要手段，細胞培養條件下，將細胞從複雜的體內環境轉移到較爲簡單的體外環境，可對細胞學研究中的變量進行分離和控制。上世紀70年代以來，國外學者對牙周膜細胞（Periodontal LigamentCells PDL）分離純化進行了大量的探索和研究，且成功地從猴、豬、人等牙周膜分離培養出牙周膜細胞［1～3］。人牙周膜細胞（hPDL）分離培養主要有酶消化法和組織貼塊法［4］。國內外學者對這2種方法評價不一，並且在這2種方法的基礎上進行改進提出了酶消化組織塊法和全牙消化法［5］。對組織塊法、酶消化組織塊法和全牙消化法這3種方法做了一些比較，以尋求hPDL體外培養的`最佳方法。
1 材料和方法
1.1 試劑及主要實驗儀器設備
α-MEM 培養液（Hyclone，USA），膠原酶（Type I，Sigma，USA），胎牛血清（杭州四季青），胰蛋白酶（配成0.25 %,過濾分裝，冷凍儲存），青黴素 100 U/ml，鏈黴素 100 mg/L；SABC 免疫組織化學試劑盒（武漢博士德），角蛋白抗體及波絲蛋白抗體（武漢博士德），二氧化碳恆溫培養箱，倒置相差顯微鏡，血球計數板。
1.2 方法
1.2.1 組織塊法培養hPDL
（1）取材：選擇健康青少年（12～18 歲）正畸拔除的健康的雙尖牙，超淨工作臺內用刀片仔細刮除附着牙齦及根尖組織，用 D-Hanks液沖洗 3 次；（2）無菌處理：將牙冠浸入 5.25%次氯酸鈉溶液中 2 min，再用含高濃度雙抗的D-Haks液沖洗2遍。按照司徒鎮強［6］傳統組織塊培養法進行原代培養；（3）傳代：細胞匯合至培養瓶 80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化傳代。
1.2.2 酶消化組織塊法培養hPDL
酶消化組織塊法原代培養在取材、無菌處理上與組織塊法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜後，不剪，移入離心管內。0.1%膠原酶37 ℃消化30 min，其中，每5 min振盪1次，當肉眼觀察到培養液略混濁，顯微鏡下見組織塊鬆散時，離心，棄上清液，用含血清及雙抗的培養基漂洗1次後棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪於培養瓶底，翻轉培養瓶，向內加入 4 ml 培養液，置CO2培養箱孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉培養瓶培養；傳代與組織塊法相同。
1.2.3 全牙消化法培養hPDL
全牙消化法原代培養牙周膜細胞取材、無菌處理與組織塊法相同。將牙齒放入裝有0.1%膠原酶的青黴素小瓶內，牙根向下，使消化液浸沒牙根，37 ℃溫箱內消化1 h，用吸管充分吹打牙根表面，加入等量含血清的培養基，離心，棄上清液，加入3 ml培養基（含10%胎牛血清、青黴素 100 U/ml、鏈黴素 100 mg/L）吹打形成細胞懸液，移入25 ml培養瓶內，置CO2培養箱內進行培養，3 d換液1次，待細胞鋪至瓶底80%時用0.25%胰蛋白酶1∶2消化傳代。
1.3 細胞的生長情況觀察
1.3.1 倒置相差顯微鏡連續觀察細胞原代和傳代生長情況。
1.3.2 HE染色
取生長狀態良好的第5代細胞進行爬片，用蘇木精-伊紅染色，觀察細胞形態。
1.3.3 細胞免疫化學染色
將培養的第3代hPDL接種於置有蓋玻片的培養瓶中，按常規 SABC 法操作，進行波絲蛋白抗體、角蛋白抗體染色，光鏡下觀察染色情況。