1共焦顯微原理與系統方案
基於針孔式掃描盤建立的快速共焦顯微系統的結構如圖1所示，激發光源發出的光經過準直、擴束之後，透過分光鏡，依次經過快速掃描盤和顯微物鏡。物鏡匯聚的激發光照射在樣品上，樣品受激發射的熒光按照原光路返回，當發射熒光經過快速掃描系統時，被濾去物方非焦面發射的雜散光。分光鏡反射的熒光經過透鏡匯聚後被CCD接收，獲取樣品共焦顯微圖像。透過控制樣品在Z軸上步進，進而改變樣品的光切位置，可以獲得樣品不同切面的圖像，最終透過一定的圖像處理技術可以獲得樣品的三維圖像。
2EMCCD相機結構與組件內容
圖1所建立的共焦顯微系統以針孔盤作爲掃描部件，它以多點針孔同時對視場進行掃描，因此，圖像採集器件宜採用面陣器件，綜合探測靈敏度、圖像輸出幀頻、空間應用等角度考慮，系統採用EMCCD作爲圖像採集器件。它與傳統CCD器件在感光、存儲等結構上並無差異，之所以在探測靈敏度、信噪比上表現出色，是因爲在其讀出寄存器之後又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的單個倍增單元如圖2所示。與普通的三相CCD轉移電極相比，EMCCD將Ф2分爲Ф2和Фdc，一般Фdc接2V左右的直流偏置，Ф2接高壓(40V左右)轉移時鐘，由於Ф2與Фdc之間存在高壓差，當信號電荷從Ф1向Ф2轉移時，強電場會使電荷加速並與其他電荷碰撞產生新的電子，電子被Ф2勢井收集實現1次信號倍增。單個倍增單元的倍增率是隨機的，一般在1%～1．5%範圍內，雖然單個倍增單元增益很低，但當多個倍增單元級聯時，總增益由式(1)確定G=(1+g)n．(1)其中，g爲單個倍增單元的倍增率，n爲倍增單元數，當n取500時，總增益可能達2000倍以上。系統採用英國E2V公司的`CCD97器件作爲成像探測器［3］，CCD97是減薄背照式幀轉移型EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸爲16μm×16μm，它同時具有普通模式與倍增模式成像方式，相應具有兩路讀出放大器。倍增模式下製冷到－40℃，可達30photons/pixel/s(積分時間爲0．1s)的探測能力，滿足弱光探測需求，同時在11MHz像素時鐘下，噪聲低於1電子/pixel，量子效率達90%以上，滿足高幀頻需求。整套系統的電子學設計圍繞EMCCD的驅動需求展開，按功能主要劃分爲3個模組:邏輯驅動模組、功率驅動模組和上位機圖像採集模組，系統功能框圖如圖3所示。
2．1邏輯驅動模組
邏輯驅動模組主要完成EMCCD幀轉移、行轉移、行輸出等邏輯信號輸出、AD時序控制輸出、SＲAM時序控制輸出以及圖像數據串行輸出等功能，邏輯模組核心器件採用ACTEL公司的APA300器件，它基於Flash技術，無需配置芯片，功耗低，對固件錯誤有較好的免疫作用，可以抵禦一些高能粒子的衝擊，最大優勢在於在特殊環境下可以穩定可靠地工作，適合航天領域的應用。圖像信號採集部分用AD9824，它是ADI公司一種專用於CCD信號處理的AD器件，它包含14位精度最高採樣率爲30MSPS的A/D轉換器，芯片內部集成了相關雙採樣電路、像素增益放大器、可編程增益放大器。邏輯驅動模組的硬件程序各子模組的調用關係如圖4所示。
2．2功率驅動模組
CCD97的驅動除了對信號相位要求嚴格外，還要求信號電平和上升時間多樣化，針對不同信號的電平和上升時間需求，功率驅動模組採用4種電路方案，包括偏置電平電路、圖像轉移信號電路(ФIS，ФＲ)及高壓時鐘電路。由於CCD97直流偏置所需電流不大，所以，偏置電平電路採用電阻分壓與運放跟隨實現。圖像轉移信號上升時間較短，需要較大的驅動電流，圖像幀轉移、行轉移、行輸出信號功率驅動電路以EL7457作爲核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS專用驅動器，最高工作頻率可達40MHz，最大驅動電流2A，具有低輸出阻抗、外圍電路簡單、方便電源管理等優點，非常適用於多電平復雜時序的CCD器件驅動設計。圖像轉移信號功率驅動電路如圖5所示［4］，由於ФI，s，ФＲ信號的上升時間要求不同，實際調試電路時選擇合適的電阻器(Ｒ1～Ｒ5)使得信號上升時間儘量滿足器件需求，保證輸出的圖像質量較高。高壓時鐘是實現倍增模式成像的關鍵信號，它的電平決定了倍增增益，並最終影響器件在低照度下的成像效果。由於高壓時鐘的電平較高，一般在40V左右，驅動電流100mA左右，使用集成元件很難實現，所以，高壓時鐘電路採用分立元件實現，電路如圖6所示［5］。圖中電路的靜態偏置由二極管D1，D2，D3，D4，D5，D6以及電阻器Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4所組成的分壓網絡提供。Q1的柵源極靜態電壓約爲－1V，Q2的柵源極靜態電壓約爲1V。當FPGA驅動脈衝爲低時，U1和U2的輸出爲5V，Q1的柵源極電壓爲－1V，Q2的柵源極電壓爲6V，此時，Q1關斷，Q2導通，2HV被拉低到0V;當FPGA脈衝爲高時，U1和U2的輸出爲0V，Q1的Vgs爲－6V，Q2的Vgs爲1V，此時Q2關斷，Q1導通，Ф2HV被拉高到電源電壓Vhigh。Ф2HV的輸出相位與FPGA輸出邏輯信號相同，高低電平與高壓電源一致。
2．3上位機軟件
上位機控制軟件主要負責指令編碼、指令下傳以及圖像數據接收、圖像數據存儲、圖像顯示等工作。上位機軟件開發環境爲VC++6．0，透過調用操作系統自帶的MScomm控件完成指令下傳與數據接收。透過點擊介面上的“開啟串口”按鈕建立相機與上位機間的通信，點擊“開啟相機”按鈕完成相機參數與開機指令下傳，開啓圖像數據接收線程，待正確接收數據包頭並完成一整幅圖像數據接收後，顯示接收圖像並儲存圖像數據。
3圖像採集驗證與分析
驗證實驗鏡頭採用MV2514機器視覺鏡頭，該鏡頭放大倍率爲0．23倍，焦距爲25mm，F數可小至1．4，可見光波段內透過率約90%，機械接口爲標準C接口，可相容2/3inCCD，最小工作距130mm。實驗中採用6mm特寫環在0．01lx微光、100ms積分時間、2dB增益條件下使用普通模式與倍增模式分別對同一目標成像，圖像如圖7所示。從獲得的暗背景條件下的圖像數據可計算出噪聲平均灰度值與方差，分別選擇普通模式下與倍增模式下目標圖像的最亮點作爲信號，取多幅圖像數據的亮點信號並計算平均值，可以獲得普通模式下與倍增模式下的信噪比，列於從表中可以得出:相比普通模式，在44V倍增時鐘電壓驅動下，倍增模式輸出圖像的信號有7倍提升，信噪比也有8倍提升，證明CCD97在微弱光條件下，使用倍增模式可以獲得較高質量的目標圖像。根據圖1搭建共焦顯微系統，使用40倍物鏡對擬南芥進行熒光顯微成像。普通顯微模式與共焦顯微模式分別對樣品所成圖像如圖8所示。EMCCD相機倍增模式與普通模式使用相同AD增益，積分時間分別取100，50ms。從圖8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以獲得比較清晰的擬南芥葉肉共焦顯微熒光圖像。相比普通顯微模式，由於對樣品進行光切的原因，使得系統在共焦顯微模式下可以清晰的分辨出擬南芥葉肉葉綠體。
4結論
透過對空間生命科學實驗中共焦顯微的原理分析，提出一套適用於活體目標觀察、對樣品低損傷的共焦顯微方案。根據目標的掃描方案和獲取目標發射光的能量大小提出基於CCD97的弱光圖像採集系統，將系統分成3個功能模組分別實現並最終完成原理樣機研製。在普通模式與倍增模式下分別獲取目標圖像，從圖像效果可以看出:該成像系統性能較高，對弱光目標有很好的成像效果，且該系統具有體積小、可靠性高、適合空間應用等特性。