CLA對HepG2細胞脂肪堆積的影響

【摘要】目的 研究共軛亞油酸對HepG2細胞中脂質沉積的影響。方法  以HepG2細胞爲研究對象，以不同濃度CLA（10μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用細胞24小時，採用油紅染色、RT-PCR等方法檢測肝臟脂肪沉積、ACC mRNA表達，觀察CLA對肝細胞內脂質沉積的影響。結果  CLA增加HepG2細胞中脂質沉積，50μmol·L-1CLA組細胞中紅染脂滴與對照組相比明顯增多；CLA使HepG2細胞培養液中游離脂肪酸降低，50μmol·L-1組的培養液中游離脂肪酸與對照組相比含量降低了50%（P< 0.05）；CLA增加HepG2細胞ACC mRNA的表達，ACC mRNA表達水平隨CLA濃度增加而增高。結論  CLA可增加HepG2細胞的脂肪沉積；其機制可能與CLA能夠改變肝細胞中ACC的表達有關。
【關鍵詞】共軛亞油酸 (CLA)   HepG2細胞  脂肪代謝  ACC
        共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一組具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸的異構體構成的混合物。1987年Michael Pariza研究小組分離出CLA，能夠抑制化學誘導的面板腫瘤形成[1]。CLA有減輕肥胖、抗腫瘤、防止動脈粥樣硬化、提高機體免疫力、增加骨密度、促進生長等多種生理功能。但是一些研究發現，CLA在減少體內脂肪的同時，可能出現肝臟脂肪代謝障礙，出現肝臟脂肪沉積的現象，其確切的分子機制尚不明確[2]。本實驗就是研究CLA對肝臟細胞脂肪堆積的影響。
        1  材料
        1.1 HepG2細胞  
        第四軍醫大學營養與食品衛生學教研室惠贈。
        1.2 主要試劑
        高糖DMEM培養基，Gibco公司；新生小牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，Wolsen公司，四甲基偶氮噻唑蘭(MTT)，Amresco公司；油紅O-0625，Sigma公司，共軛亞油酸（CLA），Sigma公司；遊離脂肪酸測試盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen公司；反轉錄試劑盒Fermentas公司葡萄糖試劑盒，上海復星公司。
        1.3 主要儀器與設備
        NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差顯微鏡，YI-875SA醫用超淨工作臺，酶聯免疫檢測儀，MyCycler thermal cycle，凝膠成像儀等。
        1.4 引物  
        引物由奧達公司合成，其中ACC引物爲：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’-        TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。
        β-ACTIN引物爲：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。
        2  實驗方法
        2.1 細胞培養
        HepG2細胞置於含10％新生小牛血清的高糖DMEM培養液中，含有100 IU/ml 青黴素，100μg/ml鏈黴素，37℃、5％CO2、飽和溼度的恆溫孵箱條件下培養，用胰蛋白酶消化液消化。
        2.2 油紅O染色觀察HepG2細胞脂質沉積
        將HepG2細胞接種於放有乾淨蓋玻片的6孔板內，37 ℃、5%CO2及飽和溼度條件下培養。待細胞長至80%滿時，吸棄培養液，加入不同濃度CLA作用24小時後，終止培養；棄培養液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室溫孵育5分鐘。除去甲醛溶液，加入同等體積的10%甲醛室溫孵育1小時，用錫紙包封好避免乾燥；除去甲醛溶液，60%的異丙醇沖洗，完全乾燥；加入油紅O工作液放置10分鐘，除去油紅O立即用蒸餾水沖洗4次，晾乾後在倒置顯微鏡下觀察。
        2.3 染色法測定培養液中的遊離脂肪酸
        將HepG2細胞以每孔5×104個細胞接種於24孔培養板內，37℃、5%CO2及飽和溼度條件下培養。待細胞長至80%滿時，吸棄培養液，將實驗組分爲1%血清的DMEM培養液空白對照組（無細胞），正常細胞對照組（含1%血清的DMEM培養液）、CLA干預組(濃度爲0、10、50、100μmol·L-1)，每組設3孔並列，孵箱中培養24小時後吸棄培養液，CLA干預組每孔加入1ml 100nmol·L-1的`胰島素溶液作用1小時後，按照試劑盒說明書方法，採用比色法測定培養液中游離脂肪酸的變化，同時24孔板內細胞胰酶消化後細胞計數板計數。
        2.4 胞總RNA的提取
        用TRIZOL試劑按操作說明書提取，提取的RNA用約25μL DEPC 處理水溶解。
        2.5 RNA純度鑑定
        取RNA5μL，稀釋100倍後用紫外分光光度計測定其OD260和OD280值，並計算OD260/OD280值及RNA濃度。
        2.6 cDNA的合成
        （1）以提取的總RNA3μg爲模板，cDNA合成反應體系爲12μL，包括：提取的總RNA模板3μg，Primer Oligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水補至12μL。3-5sec離心混勻，65℃加熱5min後置於冰浴中。
        （2）逆轉錄反應 反應體系包括：5×RTbuffer 4μL；RNase Inhibitor 1μL；10mMdNTPmix 2μL；Rever Tra Ace 1μL；補水到20μL。3-5sec離心混勻，37℃孵育5min後冰浴。
        （3）加入M-MuLV反轉錄酶1μL，總體積爲20μL。離心混勻，3-5s，42℃孵育60min。
        （4）70℃加熱10min以終止反應。合成的cDNA儲存於-20℃或用於擴增。
        2.7 PCR反應體系
        10×Reaction Buffer 5μL；10mM dNTPs 1μL；Primer1(P1)和 Primer2(P2) 各20pmol；cDNA 2μL；KOD-Plus 1μL； H2O 33μL，總體積爲50μL。