1 引言
胰島素抵抗和β細胞功能缺陷是2 型糖尿病特徵性病理生理學改變，其中胰島素抵抗是2 型糖尿病的發病機制中一重要環節，胰島素抵抗主要表現之一爲胰島素敏感組織(肌肉、脂肪組織)葡萄糖攝取減少。格列喹酮作爲第二代磺脲類藥物，其主要作用是透過促進胰島素分泌而控制血糖。隨着學者們對磺脲類藥物作用機理研究的深入，格列喹酮經典途徑以外的降糖機制也逐漸引起大家的關注。Rinninger F 等[i]研究發現，格列喹酮可透過誘導體外培養的肝臟細胞糖原合成增加而發揮胰腺外作用，Marco 等[ii]研究發現格列喹酮可誘導3T3-L1成纖維細胞PPARγ 靶基因GLUT4 的表達，其作用效應與吡格列酮相近。本研究旨在透過體外葡萄糖攝取實驗，觀察格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取作用及對胰島素刺激的糖攝取的影響，並初步探討格列喹酮的胰腺外降糖作用機制，爲進一步闡明其臨牀作用提供新的實驗依據。
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 細胞株
小鼠成肌細胞株(C2C12) ,由德國烏爾姆大學劉躍飛教授惠贈。
2.1.2 主要試劑
DMEM 培養基（Gibco 產品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），馬血清（Gibco產品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙錠（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆轉錄酶MMLV 酶、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，瓊脂糖（Gibco 公司），3H -2-脫氧葡萄糖（Amersham 產品），格列喹酮（北京萬輝雙鶴藥業），其它試劑均爲國產分析純。
2.2 方法
2.2.1 C2C12 的培養
加入含 10%胎牛血清的DMEM 培養基，置於37℃、含5％CO2 的培養箱中培養，隔日換液，待細胞生長至70％~80％融合時按1：4 傳代。
2.2.2 C2C12 誘導分化
C2C12 細胞達80%左右融合時，傳代接種於干預板中，待生長至80%~90%融合時，換用分化培養基（含2%馬血清的DMEM 培養基）誘導分化(day0)，每24 小時換液一次；5-7天后90%以上成爲成熟骨骼肌細胞用於實驗。
2.2.3 葡萄糖氧化酶法檢測細胞培養基中葡萄糖水平
細胞接種於 6 孔板，給藥組在細胞分化後分別加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰島素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰島素的DMEM，同時設立空白組、不含細胞的DMEM 組。溫育12 h 後再將培養基移出並用葡萄糖氧化酶法檢測培養基中的含糖量。用DMEM 組含糖量的平均值減去其餘各孔的含糖量，即是12h 各孔細胞的葡萄糖消耗量。收集細胞提取總RNA。
2.2.4 採用四甲基偶氮唑鹽法評估格列喹酮對C2C12 細胞增殖的影響
取體外培養的C2C12 細胞，0.25%的胰酶溶液消化，製成單細胞懸液，1000 r/min 離心5min，以含10％胎牛血清的DMEM 培養基重懸。血細胞計數板進行細胞計數，細胞懸液密度爲3.4×106 /L，接種至96 孔板，200μL/孔。實驗共分4 組：空白對照組、10-7mol/L 胰島素組、10-5mol/L 格列喹酮組、格列喹酮+胰島素組，6 個平行孔/組。各組在37℃、5％CO2細胞培養箱內常規培養。待細胞融合率達80%且未出現細胞分化時，藥物組分別向C2C12細胞中加入含對應濃度藥物的無血清培養基，空白對照組則向C2C12 細胞中加入單純無血清培養基。各組細胞干預12 h 後進行四甲基偶氮唑鹽檢測。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑鹽液20μL，37℃繼續培養4 h，鏡下可見紫藍色針狀結晶。吸出孔內培養基後，每孔加入二甲基亞碸200μL，室溫下將平板置於微孔板振盪器上振盪10 min，待結晶物溶解後，置於酶聯免疫儀於490 nm 處檢測各孔吸光度值。
2.2.5 3H -2-脫氧葡萄糖攝取實驗
細胞接種於 24 孔板，給藥組在細胞分化後分別加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同時設立空白組。用KRP 緩衝液洗滌3 次後，加入含10-7mol/L 胰島素的KRP 緩衝液，在37℃繼續培養30min，然後加入3H -2-脫氧葡萄糖，使終濃度爲3.7×104Bq/L，作用15 min 後，用冷PBS 洗滌3 次，用0.1mol/L 的NaOH 裂解細胞，取細胞裂解液用液閃儀計數其每分鐘計數(CPM)。每一樣本測定的CPM 值用與對照組的比例表示。
2.2.6 RT-PCR 法檢測GLUT4 mRNA 表達
採用 Trizol 一步法提取各組細胞的總RNA，經紫外分光光度計測定RNA 的A260nm 與A280nm 比值在1.60～1.90 之間。取4μl 總RNA 爲模板逆轉錄，根據文獻，並與從Gene Bank上下載的人GLUT4 mRNA、β-actin mRNA 核苷酸序列覈對，由上海生工合成GLUT4 和β-actin 單核酸引物。GLUT4 上游: 5’- gcccgaaagagtctaaagcg -3’ ， 下游: 5’-actaagagcaccgagaccaa-3’，擴增產物長312bp。β-actin 上游:5’- cgtgcgtgacattaaagag -3’，下游: 5’-ctggaaggtggacagtgag- 3’，擴增產物長435bp。擴增條件: 95℃ 5min 預變性，然後95℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s 進行35 個循環，再以72℃延伸10min，再以72℃延伸10min。反應完成後取5μl PCR 產物於2%瓊脂糖凝膠（含0.5mg/ L 溴化乙錠）電泳，用Sensicapture 自動凝膠成像分析儀掃描凝膠圖譜，LabImage 分析軟件對RNA 條帶進行分析，得出GLUT4 與內參照條帶β-actin 的吸光度比值，比較各組GLUT4mRNA 相對錶達情況。
2.3 統計學處理
應用 SPSS 13.0 軟件包對實驗數據進行統計，所有數據都用?x±s 表示，採用one-wayANOVA 進行顯著性檢驗，組間比較採用S-N-K 檢驗，以P < 0.05 爲差異有統計學意義。
3 結果
3.1 格列喹酮對C2C12 細胞培養基中葡萄糖消耗的影響
結果顯示，干預12h 後，胰島素組C2C12 細胞葡萄糖消耗量明顯增加，高於空白組（12.34±0.55 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮組細胞耗糖量亦明顯增加（10.95±0.46 vs 7.86±0.63，P<0.01），格列喹酮+胰島素組細胞耗糖量較胰島素組增多（13.77±0.73 vs 12.34±0.55，P<0.01）。
3.2 格列喹酮對C2C12 細胞增殖的影響
四甲基偶氮唑鹽檢測結果表明，細胞處理12 h 後，與空白組比較, 胰島素組、格列喹酮+胰島素組平均吸光度值均顯著增加（0.74±0.09，0.76±0.09 vs 0.54±0.06，P<0.01），而格列喹酮組平均吸光度值無明顯變化（0.55±0.089 vs 0.52±0.063，P>0.05）。
3.3 格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取的影響
C2C12 細胞在基礎狀態下對葡萄糖有一定的攝取，胰島素刺激可使細胞葡萄糖攝取增加（爲空白組的1.68±0.09 倍，P<0.01）；10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L 格列本脲孵育細胞12h 後，與空白組相比，細胞對葡萄糖的攝取均增加（分別爲1.52±0.23 倍、1.23±0.16 倍，P<0.01）；與格列苯脲相比，格列喹酮組細胞葡萄糖攝取增高更明顯（P<0.01）；在胰島素存在的情況下，格列喹酮組細胞葡萄糖攝取明顯增加（爲空白組的1.93±0.12 倍，P<0.01），且高於胰島素組（P<0.01），見格列喹酮對C2C12 細胞葡萄糖攝取的影響。
3.4 格列喹酮對C2C12 細胞GLUT4 mRNA 表達的影響
胰島素和格列喹酮干預C2C12 細胞12 小時結果顯示，胰島素組GLUT4 mRNA 表達高於空白組（0.73±0.04 vs 0.47±0.02，P<0.01），格列喹酮組GLUT4 mRNA 表達與空白組